Untersuchungen zur Biosynthese von Urdamycin A und Herstellung neuer Naturstoffe mittels molekularbiologischer Methoden

Abstract

Urdamycin A, das Hauptprodukt von Streptomyces fradiae Tü2717, gehört zur Gruppe der Angucyclin-Antibiotika und zeigt antitumorale sowie antibakterielle Aktivitäten. Es enthält eine C-glycosidisch gebundene D-Olivose und drei weitere O-glycosidisch gebundene Desoxyzucker: zwei L-Rhodinosen und eine weitere D-Olivose. Um Gene identifizieren zu können, die an der Biosynthese der Desoxyzucker sowie an Tailoring Reaktionen beteiligt sind, wurde ein 8kb großes Fragment aus dem Biosynthesegencluster von Urdamycin A kloniert und sequenziert. Dabei konnten 7 neue Offene Leserahmen (urdL, urdM, urdJ2, urdZ1, urdGT2, urdG und urdH) detektiert werden. Deren abgeleitete Genprodukte zeigten Homologien zu bekannten Cyclasen (UrdL), Oxygenasen (UrdM), Transportern (UrdJ2), Desoxyzucker-Biosynthesegenen (UrdZ1, UrdG, UrdH) und Glycosyltransferasen (UrdGT2). Um Aufschluß über die mögliche Funktion der Gene urdM, urdGT2 und urdZ1 zu erhalten, wurden Geninaktivierungsexperimente durchgeführt. Die Inaktivierung von urdZ1 über frame-shift Mutation führte zu einer Mutante, die Urdamycinon B produziert. Dies läßt vermuten, daß urdZ1 für eine dNDP-Hexose-3,5-Epimerase codiert, die an der Biosynthese des Desoxyzuckers L-Rhodinose beteiligt ist. Die Inaktivierung von urdM über in-frame Deletion resultierte in einer Mutante, die überwiegend Rabelomycin akkumuliert. Daraus kann gefolgert werden, daß UrdM die Oxygenierung an Position 12b des Urdamycin A katalysiert. Die Mutante, die durch Inaktiavierung von urdGT2 über in-frame Deletion erhalten wurde, produzierte die Urdamycine I, J und K anstelle von Urdamycin A. Diese neuen Urdamycine weisen an Position C-9 keine C-C-verknüpfte D-Olivose auf. Es kann deshalb angenommen werden, daß UrdGT2 den C-Glycosyltransfer einer NDP-D-Olivose katalysiert. Die heterologe Expression ganzer Gencluster oder einzelner Gene in verschiedenen Wirtsstämmen, bzw. die Expression verschiedener Glycosyltransferasegene in der urdGT2-Mutante führte zur Produktion n

Urdamycin A, the major product of Streptomyces fradiae Tü2717, belongs to the group of angucycline antibiotics and exhibits antitumoral and antibacterial activity. It contains a C-glycosidically linked D-olivose and three additional O-glycosidically linked desoxysugars: two L-rhodinoses and another D-olivose. To characterize genes beeing involved in the biosynthesis of desoxysugars and tailoring reactions, a 8 kb fragment of the urdamycin A biosynthetic gene cluster has been cloned and sequenced. 7 new ORFs (urdL, urdM, urdJ2, urdZ1, urdGT2, urdG and urdH) have been detected, their deduced products showing similarities to known cyclases (UrdL), oxygenases (UrdM), transporters (UrdJ2), desoxysugar biosynthetic genes (UrdZ1, UrdG, UrdH) and glycosyltransferases (UrdGT2). To determine the function of urdM, urdGT2 and urdZ1, targeted gene inactivation experiments were performed. Inactivation of urdZ1 by frame-shift mutation led to a mutant producing urdamycinone B. This might indicate that urdZ1 encodes a dNDP-hexose-3,5 epimerase which is involved in the biosynthesis of the desoxysugar L-rhodinose. The in-frame deletion of urdM generated a mutant strain accumulating predominantly rabelomycin. UrdM might be involved in oxygenation at position 12b of urdamycin A. The mutant, in which urdGT2 had been deleted by in-frame deletion produced urdamycin I, urdamycin J and urdamycin K instead of urdamycin A. All these new derivatives are missing the C-C connected D-olivose at position C-9, indicating that UrdGT2 catalyses the C-glycosyltransfer of one NDP-D-olivose. Heterologous expression of entire gene clusters or single genes in different host strains or expression of different glycosyltransferase genes in the urdGT2-mutant, respectively, resulted in the production of novel natural compounds. However, due to the very low production level, the structure of these compounds could not be determined.