Molekularer Mechanismus und strukturelle Implikationen des pH-Gatings einwärtsgleichrichtender K+-Kanäle (Kir)

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URI: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:21-opus-938
http://hdl.handle.net/10900/48081
Dokumentart: PhDThesis
Date: 2000
Language: German
Faculty: 7 Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät
Department: Sonstige - Chemie und Pharmazie
Advisor: Fakler, Bernd
Day of Oral Examination: 2000-01-13
DDC Classifikation: 540 - Chemistry and allied sciences
Keywords: Wasserstoffionenkonzentration , Intrazellulärraum , Kaliumkanal , Niere
Other Keywords: Einwärtsgleichrichtende Kaliumkanäle , Nierenphysiologie , Intrazellulärer pH , Ionenkanal-Gating , Erbliche Tubulopathien
Inward-rectifier potassium channels , Renal physiology , Intracellular pH , Ion channel gating , Hereditary tubulopathies
License: http://tobias-lib.uni-tuebingen.de/doku/lic_ubt-nopod.php?la=de http://tobias-lib.uni-tuebingen.de/doku/lic_ubt-nopod.php?la=en
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Inhaltszusammenfassung:

Der Einwärtsgleichrichter-K+-Kanal ROMK (Kir1.1) ist für die K+-Sekretion und die Kontrolle der NaCl-Rückresorption in der Niere verantwortlich und zeichnet sich durch sein Gating durch den intrazellulären pH (pHi) aus (pKapp=6.8 / h=2.9). Der Sensor-Mechanismus des pH-Gatings und damit verbundene Konformationsänderungen waren Thema dieser Arbeit. Mit Thiol-Reagenzien wurde eine irreversible Hemmung der Kanäle im geschlossenen, aber nicht im offenen Zustand beobachtet. Durch gezielte Mutagenese wurden Cystein 49 im N- und Cystein 308 im C-Terminus als zustandsabhängig modifizierbare Reste identifiziert. Ferner benätigten Kir1.1-Kanäle für ihre Aktivität extrazelluläre K+-Ionen, eine Eigenschaft der P-Region, die allosterisch an das pH-Gating gekoppelt war: Ohne extrazelluläres K+ blieben die Kanäle zwar bei alkalischem pHi aktiv, die Inaktivierung in saurem pHi war aber irreversibel. Beim pH-Gating von Kir1.1-Kanälen kommt es also zu Konformationsänderungen in N- und C-Termini sowie in der Porenregion. Sequenzvergleich und gezielte Mutagenese identifizierten N-terminal von M1 einen Lysin-Rest (K80) mit stark verschobenem pKapp (3 pH-Einheiten unter dem Standardwert) als pHi-Sensor identifiziert. Substitution von K80 durch eine neutrale Aminosäure oder chemische Modifikation dieses Restes beseitigten das pH-Gating. Umgekehrt war letzteres durch Einfügen von Lysin an der homologen Stelle auf andere Kir-Kanäle übertragbar. Das anormale Titrationsverhalten lie§ sich durch elektrostatische Wechselwirkungen in einer Triade von basischen Aminosäuren erklären (K80, R41 in N- und R311 im C-Terminus). Diese Ergebnisse liefern erste Hinweise auf die Tertiärstruktur intrazellulärer Domänen von Kir-Kanälen. Mutationen in der R/K/R-Triade, wie sie auch in Familien mit Antenatalem Bartter-Syndrom (ABS) gefunden wurden, inaktivieren Kir1.1 und führen so zum klinischen Bild einer Salzverlustniere. In einem abgeleiteten Strukturmodell lag auch die Mehrzahl der anderen ABS-Punktmutati

Abstract:

ROMK (Kir1.1), a member of the family of inwardly rectifying K+ channels (Kir) mediates K+ secretion and controls NaCl reabsorption in the kidney. A hallmark of these channels is their gating by intracellular pH (pHi) (pKapp=6.8 / h=2.9). In this study, the trigger mechanism of pH-gating and the associated conformational changes in Kir1.1 were investigated. When probed with sulfhydryl modifying agents, irreversible inhibition was observed in the closed but not in the open channel state. Mutagenesis revealed cysteine 49 in the N- and cysteine 308 in the C-terminus as targets for state-dependent modification. Moreover, Kir1.1 channels require extracellular K+ ions for activity, a property that is determined by the P-region and allosterically linked to pH-gating. In the absence of extracellular K+, open channels (pHi=8.0) remained active but failed to recover from pH-induced inactivation. Thus, pH-gating of Kir1.1 channels involves conformational changes in both N- and C-termini as well as in the pore region. By sequence alignment and site-directed mutagenesis a lysine residue N-terminal to M1 (K80) displaying a strong shift in pKapp (-3 pH units compared to the free amino acid) was identified as the pHi sensor. Replacing K80 by a neutral amino acid or chemical modification of amino groups removed pH-gating. Conversely, introduction of lysine at the pre-M1 site conferred pH-gating to other Kir channels. The anomalous titration was found to be due to electrostatic interactions within an intrasubunit triad of basic groups (K80, R41 in the N- and R311 in the C-terminus). These results provide a first framework for the tertiary folding of intracellular domains of Kir channels. Mutations in the R/K/R triad, as found in families with antenatal Bartter syndrome (aBS), inactivate ROMK and thereby lead to the clinical phenotype of a salt-wasting tubulopathy. Moreover, in a structural model deduced from the findings reported here, the majority of Kir1.1-aBS missense mutations

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