Aufbau, Charakterisierung und Optimierung eines homogenen Fluoroimmunoassays für die Affinitätsanalytik in Nanolitervolumina

Abstract

Im Bereich der Umweltanalytik gewinnen immunologische Testverfahren zunehmend an Bedeutung. Typische Testvolumina konventioneller Mikrotiterplattentechniken betragen 50-250 µl. Für kosteneffiziente Anwendungen mit hohem Probendurchsatz müssen die Volumina in den Submikroliterbereich verringert werden. Hier sind Waschschritte, wie sie in herkömmlichen Immunoassays erforderlich sind, nicht mehr praktikabel. In diesem Zusammenhang wird für beispielhafte Umweltschadstoffe (Pestizide) ein homogener Fluoroimmunoassay entwickelt, welcher auf Resonanz-Energie-Transfer-Effekten (RET) basiert. Der RET findet zwischen einem Fluorophor (Donor) und einem absorbierenden Molekül (Akzeptor) statt, sofern sich das Emissionsspektrum des Donors mit dem Absorptionsspektrum des Akzeptors überlappen. Die Transfer-Effizienz ist stark abstandsabhängig (reziprok zur sechsten Potenz des Donor-Akzeptor-Abstandes), so daß ein homogener Assay etabliert werden kann. Für diesen Assay werden mikrostrukturierte Probenträger (Nanotiterplatten [NTP]) im Format von etwa 2x2 cm^2 mit Kavitäten zwischen 50 nl und 70 nl Volumen verwendet. Für die Probenhandhabung kommen piezoelektrische Dosiersysteme zum Einsatz, die sich zur präzisen Dosierung von Flüssigkeiten (± 1) im (Sub)-Nanoliterbereich eignen. Um die Verdunstung des Wasseranteils zu vermeiden, werden die NTP mit Hilfe von Peltierelementen bis kurz vor den Taupunkt gekühlt. Die Detektion der Fluoreszenz erfolgt mit einem experimentell aufgebauten NTP-Leser. Hier wird ein Laserstrahl über einen 2D-Scanner auf die NTP gelenkt und so Punkt für Punkt sehr schnell abgetastet. Mittels eines Photomultipliers wird die laserinduzierte Fluoreszenz der Proben gemessen. Aufgrund der geringen Hintergrundfluoreszenz und wegen der guten Verfügbarkeit von preiswerten Lichtquellen wurden zwei langwellige Fluorophore Cy5 (Donor) und Cy5.5 (Akzeptor) ausgewählt. Die Antikörper wurden mit Cy5 markiert, während die Analytderivate über Rinderserum Albumin als Träge

In the field of environmental analysis, immunological methods have become more and more popular. These procedures have proven to be fast and simple, particularly because no or little sample preparation is required. Typical test volumes employed are between 50-250 µl. The costs of the assays can drastically be reduced by decreasing the volumes below 1 µl. Thus the screening of large numbers of samples will become more feasible. We investigated the feasibility of immunoassays on microstructured sample carriers (nanotiterplates). Well sizes of 0.5 mm to 1 mm edge length and volumes of 10 nl to 100 nl were realised by silicon etching. The sample handling was accomplished by using nanoliterpumps with piezoelectric actuators. Available droplet volumes were between 50 pl and 500 pl and could be delivered very accurately (+/- 2). In order to avoid the evaporation of the dispensed liquid, the nanotiterplate was handled in a humid chamber and cooled immediately up to the point of condensation by means of a peltier element. After finishing the dispensing actions, the nanotiterplates were sealed with a transparent tape. This allowed the storage of the filled plates for several hours. Fluorescence read-out was performed using a laser scanning device especially developed for the nanowell array (Perkin-Elmer). The spatial resolution was 20 µm and the limit of detection 5 nM fluorophore-antibody conjugate in PBS. Conventional immunoassay approaches require washing steps, which are not feasible at sample size below 1 µl. Therefore we have developed a competitive homogeneous phase immunoassay based on resonant energy transfer. Resonant energy transfer occurs between a fluorescent donor and an absorbing acceptor molecule, which have overlapping emission and absorbance spectra. The transfer efficiency scales with 1/distance6, which allows to establish a proximity type assay. As donor acceptor pair two „red' (long wavelength excitable) fluorescent dyes were chosen (Cy5 as donor and C