Funktionelle Analyse von Pax7 im dorsalen Mittelhirn des Hühnerembryos und dessen Auswirkungen auf die Zellzyklusgene der G1/S- Phase

Abstract

Die vorliegende Arbeit geht der Frage nach, inwieweit die Transkriptionsfaktoren Pax7 und Pax3 als Homöoboxgene eine entscheidende Rolle in der Entwicklung spezifizierter Zellregionen im dorsalen Mittelhirn des Hühnerembryos spielen, indem sie fähig sind die Transkription der Zellzyklusgene der G1/S- Phase zu beeinflussen. Grundlegende entwicklungsbiologische Prozesse in der Embryonalentwicklung des Huhnes (Gallus gallus domesticus) lassen sich auf die der Säugetiere übertragen, weshalb in der vorliegenden Arbeit als Modellorganismus Hühnerembryonen verwendet wurden. Mittels der in ovo- Elektroporation verschiedener Plasmidkonstrukte, die entweder zu einer Überexpression von Pax7 oder Pax3 führten oder die Expression von Pax7 unterdrückten, konnten unterschiedliche Proteinkonzentrationen von Pax7 als auch von Pax3 im dorsalen und ventralen Mittelhirn erzielt werden. Die Auswirkungen der Konzentrationsunterschiede auf die Zellzyklusgene der G1/S-Phase im dorsalen und ventralen Mittelhirn wurden durch eine qualitative PCR- Analyse untersucht. Eine quantitative qRT-PCR-Analyse wurde speziell im dorsalen Mittelhirn durchgeführt.

Die qualitative PCR-Analyse im ventralen Mittelhirngewebe zeigte keinen eindeutigen Einfluss von Pax3 und Pax7 auf die Expression der untersuchten Gene und erfordert weitere Untersuchungen. Zusätzlich wurde während der PCR-Analyse im dorsalen Mittelhirn eine mögliche 65bp- kürzere Spleißvariante des Pax7- Gens detektiert. Welche Rolle diese Variante in der Spezifizierung und Proliferation neuronaler Subtypen spielt, muss in weiteren Untersuchungen analysiert werden. Die qualitative PCR-Analyse des dorsalen Mittelhirngewebes führte aufgrund inhomogener Expressionsmuster zum Ausschluss bestimmter Transkriptionsfaktoren aus der folgenden qRT-PCR-Analyse. Diese sensiblere Methodik präsentierte ein komplexes Interaktionsmuster von Pax3 und Pax7 im dorsalen Mittelhirn. Aufgrund unterschiedlicher hoher Transfektionseffizienzen der einzelnen Elektroporationen zeigte sich eine konzentrationsabhängige funktionelle Redundanz der beiden Pax- Gene ab einem bestimmten Schwellenwert. Pax7- und nicht Pax3- scheint einer negativen als auch positiven Autoregulation fähig zu sein und führte trotz Über- und Unterexpression zu ausgeglichenen Expressionsverhältnissen der Zellzyklusgene der G1/S-Phase.

Neuronale Vorläuferzellen des ZNS entscheiden während der G1- Phase des Zellzyklus, ob sie den Weg Richtung Proliferation oder Differenzierung einschlagen. In Hinblick auf kleinere Expressionsschwankungen am G1/S- Punkt müssen sie dabei ihren Expressionslevel der Transkriptionsfaktoren innerhalb ihrer Zellgrenzen stabilisieren und gleichzeitig auch dazu fähig sein auf die unterschiedliche Expression ihrer spezifischen Transkriptionsfaktoren zu reagieren. Diese schwellenwertspezifische funktionelle Redundanz der beiden Transkriptionsfaktoren als auch die positive und negative Autoregulation von Pax7 im dorsalen Mittelhirn des Hühnerembryos scheint den Zellstatus von Proliferation von Vorläuferzellen und dessen Eintritt in die Differenzierung noch genauer zu balancieren und dazu beizutragen, dass sich im dorsalen Mittelhirn geordnete regionalisierte neuronale Subtypen ausbilden können.

This thesis examines the crucial role of the transcription factors Pax3 and Pax7 in the development of specialized cell regions of the midbrain of the chicken embryo and their ability to influence the transcription of the cell cycle genes of the g1/s phase. The basic biological processes of the early CNS development of the chicken (gallus gallus domesticus) can be compared with these of the mammalian CNS development. This is why we used chicken embryos as a model organism im our experiments.

During these experiments we produced different protein concentrations in the midbrain using a technique called in-ovo-electroporation, which lead either to an overexpression of Pax7 and Pax3 or to a repression of Pax7. The effects on the concentration differences of the cell cycle genes in the midbrain were analyzed by a qualitative PCR-analysis. A quantitative qRT-PCR-analysis was additionally performed in the dorsal midbrain. The qualitative PCR-analysis of the ventral midbrain showed no clear effect of Pax3 and Pax7 on the investigated cell cycle genes and requires further investigation. In addition wie detected a possible 65bp- smaller splice variant in the dorsal midbrain. The role of this variant in the specification and proliferation of neuronal subtypes needs to be analyzed in further studies. The results of the qualitative PCR-analysis of the dorsal midbrain led to an exclusion of certain transcription factors for the following qRT-PCR-analysis due to an inhomogeneous expression pattern. This high-sensitive method presented a complex interaction pattern of Pax3 and Pax7 in the dorsal midbrain.

Due to different transcription efficiencies of the individual electroporation samples we could show a concentration-dependent functional redundancy of the two Pax-genes above a certain threshold. Pax7-and not Pax3- seems to be capable to act as a positive and negative autoregulator and to lead despite overexpression and repression to a balanced expression pattern of the cell cycle genes during the g1/s phase.

Neuronal precursor cells of the CNS decide during the g1/s phase wether to choose proliferation or differentiation. On the one hand, in terms of discrepancy of the expression pattern at the g1/s point the precursor cells can stabilize the expression level of their transcription factors and on the other hand can react to specific changes of expression patterns. This threshold specific functional redundancy of Pax7 and Pax3 and the positiv and negative autoregulation of Pax7 in the dorsal midbrain seem to balance the cell status of the neuronal precursor cells and their entry to differentiation. These feedbacks could contribute to ordered and regionalized neuronal subtypes in the dorsal midbrain.