Bewertung der Leuchtdioden-Fluoreszenz-Mikroskopie im Vergleich zu konventioneller Fluoreszenz-Mikroskopie, Lichtmikroskopie und Polymerase-Kettenreaktion zur Diagnose von Plasmodium falciparum-Infektionen in Gabun

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URI: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:21-opus-72428
http://hdl.handle.net/10900/46139
Dokumentart: Dissertation
Date: 2014
Language: German
Faculty: 4 Medizinische Fakultät
Department: Medizin
Advisor: Kremsner, Peter (Prof. Dr.)
Day of Oral Examination: 2011-11-22
DDC Classifikation: 610 - Medicine and health
Keywords: Diagnostik , Sensitivität , Fluoreszenz , Spezifität , Malaria , Plasmodium , Gabun , Plasmodium falciparum
Other Keywords:
Diagnosis , Sensitivity , Specificity , Acridine orange , Fluorescence
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Inhaltszusammenfassung:

Hintergrund: Mit etwa 300 – 500 Mio. Infektionsfällen und 1 Mio. Toten durch die Infektion mit Plasmodien bleibt die Malaria eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität weltweit. Über 90% der Todesfälle treten im tropischen Afrika auf, wo die Mehrheit der Infektionen durch Plasmodium falciparum hervorgerufen wird. Doch Malaria ist eine heilbare Krankheit. Eine schnelle und akkurate Diagnostik ist hierbei die zentrale Voraussetzung für die klinische Versorgung der Patienten. Zudem verhindert sie Fehlbehandlungen, welche zu Resistenzentwicklungen, Toxizität und wirtschaftlichen Verlusten führen können. Goldstandard ist seit 1904 die Lichtmikroskopie von mit Giemsa-Lösung gefärbter Dicker Tropfen. Unter optimalen Bedingungen ist dieses Verfahren schnell und zuverlässig, nichtsdestotrotz wäre ein schnelleres Ergebnis von großem Nutzen. Schnelltests als denkbare Alternative sind teuer und liefern nur qualitative Ergebnisse. Jedoch ist in Zeiten abnehmender Inzidenzen sowie schnellen Resistenzentwicklungen und teuren Medikamenten eine kostengünstige schnelle und zuverlässige Malaria-Diagnostik unabdingbar. Die auf Leuchtdioden basierende Fluoreszenz-Mikroskopie wurde als mögliches alternatives Diagnostik-Instrument in dieser Arbeit untersucht. Methoden: In Lambaréné (Gabun) wurden über ein Jahr die Leuchtdioden (LED)-Fluoreszenz-Mikroskopie in 400-facher (ledFM 400x) und 1000-facher Vergrößerung (ledFM 1000x) sowie die konventionelle Fluoreszenz-Mikroskopie (uvFM) in 1000facher Vergrößerung mit konventioneller Lichtmikroskopie (LM) anhand von Proben von 210 Patienten, die sich mit Fieber-Anamnese im Albert-Schweitzer-Krankenhaus vorstellten, verglichen. Die Präparate wurden mit Acridinorange und Giemsa gefärbt, ausgezählt, die Diagnose-Zeit gemessen und die Methoden mittels Sensitivität, Spezifität, Vorhersagewerte, Bland-Altmann-Plot, Cohens-Kappa-Koeffizient und Box-Whiskers-Plot beurteilt. Für nicht übereinstimmende Ergebnisse stand die quantitative Echtzeit-Polymerase-Ketten-Reaktion (qRT-PCR) als sensitive Referenz zur Verfügung. Des Weiteren wurden die Wiederholbarkeit, die Präzision und die Kosten bestimmt. Ergebnisse: Bei Festlegung der LM als Goldstandard lagen die Sensitivitäten bei 99,1% für ledFM 400x und ledFM 1000x, 97,0% für die uvFM, die Spezifitäten bei 90,7% für die ledFM 400x, 92,6% für die ledFM 1000x und bei 92,6% für die uvFM. Eine hohe Übereinstimmung zeigte sich im Bland-Altmann-Plot und anhand des Kappa-Koeffizienten (ledFM 400x: 0,895, ledFM 1000x: 0,914, uvFM 0,895). Unter Berücksichtigung der qRT-PCR als Referenz für nicht übereinstimmende Resultate lagen die Sensitivitäten bei 91,9% für die LM, bei 93,7% für die uvFM, bei 97,3% für die ledFM 400x und bei 96,4% für die ledFM 1000x, die Spezifitäten bei 100,0% für die LM, bei 97,0% für die uvFM und die ledFM 400x sowie bei 98,0% für die ledFM 1000x. Die Diagnose-Zeiten für die Fluoreszenz-Methoden waren im Vergleich zur Lichtmikroskopie kürzer (LM: 43 min, ledFM 400x: 10 min, ledFM 1000x: 14 min, uvFM: 16 min). Für alle mikroskopischen Verfahren zeigte sich eine hohe Übereinstimmung zwischen den Untersuchern sowie eine hohe Präzision und Wiederholbarkeit. Die Kosten für ein Präparat der LED-Fluoreszenz-Methode lagen bei 47,3% der Kosten eines Präparates der Lichtmikroskopie. Schlussfolgerung: Die vorliegenden Resultate zeigen hohe Sensitivitäten, Spezifitäten, aussagekräftige Vorhersagewerte und eine hohe Präzision für die Fluoreszenz-Techniken. Zudem konnte mittels qRT-PCR die LED-Fluoreszenz-Mikroskopie bei niedriger Parasitämie als sensitivere Methode bewertet werden. Die Übereinstimmung der LED-Fluoreszenz-Methoden mit der Lichtmikroskopie war akkurat. Zu denselben Ergebnissen kommt man durch die Visualisierung im Bland-Altman-Diagramm. Bezüglich Diagnose-Zeit und Kosten zeigt sich ein deutlicher Vorteil der LED-Fluoreszenz-Technik gegenüber der herkömmlichen Fluoreszenz-Mikroskopie sowie der Lichtmikroskopie. Allerdings gelingen Spezies-Differenzierung und Aufbewahrung der Präparate nur bedingt unter Verwendung der Acridinorange-Färbung. Diese Nachteile sollten durch spezifischere Färbungen in Zukunft noch verbessert werden. In jedem Fall aber ist die LED-Fluoreszenz-Mikroskopie unter Berücksichtigung der diskutierten Punkte ein zuverlässiges akkurates schnelles und vergleichsweise kostengünstiges Instrument für die tägliche Routine-Diagnostik der Malaria und somit als geeignete Methode unter einfachen Bedingungen einsetzbar.

Abstract:

Background: Rapid and accurate diagnosis of malaria is central to clinical management and the prevention of drug-overuse, which may lead to resistance development, toxicity and economic losses. So far, light microscopy (LM) of Giemsa-stained thick blood smears is the gold standard. Under optimal conditions the procedure is fast and reliable; nevertheless a gain in speed would be a great advantage. Rapid diagnosis tests are an alternative, although they cost more and give qualitative instead of quantitative results. Light-emitting diode (LED) fluorescence microscopy (ledFM 400x, 1000x) may offer a reliable and cheap alternative, which can be used at the point of care. Methods: LedFM and conventional fluorescence microscopy (uvFM) were compared to LM in 210 samples from patients with history of fever in the last 24 hours admitted to the Albert Schweitzer Hospital in Lambaréné, Gabon. For discordant results a real time PCR was the most sensitive reference method. Results: Sensitivities were 99.1% for ledFM and 97.0% for uvFM, specificities 90.7% for ledFM 400x and 92.6% for ledFM 1000x and uvFM. High agreement was found in Bland-Altman-plot and Kappa coefficient (ledFM 1000x:0.914, ledFM 400x and uvFM: 0.895). Regarding the real time PCR as a reference for the discordant results the sensitivity was 91.9% for LM, 93.7% for uvFM, 97.3% for ledFM 400x and 96.4% for ledFM 1000x. The specificity was 100.0% for LM, 97.0% for uvFM and ledFM 400x and 98.0% for ledFM 1000x. The time to diagnosis for both FM methods was shorter compared to LM (LM: 43 min, uvFM: 16 min, ledFM 1000x: 14 min, ledFM 400x: 10 min). Conclusion: ledFM is a reliable, accurate, fast and inexpensive tool for daily routine malaria diagnosis and may be used as a point of care diagnostic tool.

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