cDNA Microarray Analyse und Genexpressionprofil von sporadischen Vestibularisschwannomen verglichen mit gesundem Autopsiegewebe: Eine Betrachtungsweise auf molekularer Ebene unter Verwendung der Ingenuity Pathway Analysis Software

Abstract

Ziel: Die vorliegende Studie wurde durchgeführt um differentiell exprimierte Gene und Signalwege zwischen Tumor- und Kontrollgewebe zu identifizieren, die eine möglicherweise wichtige Rolle in der Krankheitsentstehung spielen. Zur Bestimmung des Expressionsprofils diente uns eine cDNA Microarray und die Auswertung der resultierenden Daten erfolgte mit der Ingenuity Pathway Analysis Software (IPA, www.ingenuity.com).

Hintergrund: Vestibularisschwannome sind benigne Tumore, die von den Schwannzellen des VIII. Hirnnerven ausgehen. Mit einem Anteil von 80-86% aller raumfordernden Läsionen des Kleinhirnbrückenwinkels stellen sie somit die am häufigsten dort anzutreffende Tumorentität dar. Unter den Vestibularisschwannomen werden eine unilateral sporadische Form, eine zystische Variante und eine bilateral oder auch Neurofibromatose Typ 2 (NF2)-assoziierte Form unterschieden. Letztere ist eine charakteristische Manifestation innerhalb des autosomal-dominant vererbten Tumorsyndroms, der Neurofibromatose Typ 2 (NF2). Zudem weisen die Patienten mit einer NF2 weitere benigne Tumore des Nervensystems (z.B. Meningeome), okuläre Veränderungen (z.B. Katarakte) aber auch Hautläsionen, wie beispielsweise die typischen Café-au-lait Flecken, auf. In den letzten Jahren wurden zahlreiche Mutationen innerhalb des Tumorsuppressorgens NF2 und deren Effekte auf dessen Proteinprodukt Merlin ausfindig gemacht. Im Laufe der Zeit kamen neue, molekulardiagnostische Methoden hinzu, die es uns ermöglichten weitere Gene zu identifizieren, welche potentiell eine wichtige Rolle in der Tumorgenese spielen könnten.

Methoden: Eine globale Genexpressionsanalyse (HG-U219 Array Plate, Affymetrix®), wurde für eine Gruppe von 36 sporadischen Vestibularisschwannomen und sieben postmortal gewonnenen Proben an Nn. vestibulocochlearis durchgeführt. Unter Zuhilfenahme der Ingenuity Pathway Analysis Software (www.ingenuity.com), wurden in den Tumoren deregulierte Signalwege detektiert.

Ergebnisse: Durch die Festlegung eines p-Wertes von < 0.01 und eines log Fold Change (logFC) von >=1 als signifikante cut-off-Werte, erhielten wir aus der Genexpressionsanalyse 4021 differentiell exprimierte Gene, worunter sich 2276 über- und 1745 unterexprimierte Gene fanden. Unter Berücksichtigung eines statistischen Schwellenwerts (Threshold) von 0.0001 identifizierte IPA 13 signifikant deregulierte Signalwege, unter denen sich sechs Signalwege vorfanden, die in Kategorien des Immunsystems (Zytokin-Signalkaskaden, zelluläre und humorale Immunantwort) involviert waren. Der am signifikantesten deregulierte Signalweg The Role of NFAT in Regulation of the Immune Response ließ den Nuclear factors of activated T cells (NFAT) und der T-Zellantwort eine zentrale Rolle in der Bildung von sporadischen Vestibularisschwannomen zukommen.

Schlussfolgerung: Eine wichtige Rolle bei der Formation von sporadischen Vestibularisschwannomen spielen die Genen und Signalwegen, die in Prozessen des Immunsystems involviert sind. Es gibt Hinweise darauf, dass eine gestörte Regulation dieser auf molekularer Ebene, zu einem Ungleichgewicht zwischen Tumorgenese und der Immunantwort führt. Im Speziellen scheinen die Nuclear factors of activated T cells (NFAT) und deren Transkriptionspartner eine wichtige Position darin einzunehmen. Nichtsdestotrotz bedarf es weiterer Validierungsmethoden (z.B. RT-PCR und Proteinanalysen) um die vorliegenden Ergebnisse weiter zu prüfen und um an die gewonnenen Erkenntnisse anzuknüpfen.

Objective: In this study we investigated the gene expression profile between tumor and control tissue in search of underlying disease-causing deregulated genes and pathways, using cDNA microarray technology and Ingenuity Pathway Analysis Software.

Background: Vestibular schwannomas are benign tumors arising from the Schwann cells of the 8th cranial nerve. With an amount of 80-86% of all space consuming lesions of the cerebellopontine angle, they represent the most common tumors in this location. There are different types of vestibular schwannomas which can be grouped into unilateral sporadic vestibular schwannomas, cystic schwannomas and bilateral or neurofibromatosis type 2 (NF2)-associated schwannomas. The latter are characteristic for the autosomal dominant disorder neurofibromatosis type 2 (NF2). Frequently, in patients suffering from NF2, other noncancerous tumors in the nervous system (e.g. meningiomas), ophthalmologic abnormalities (e.g. cataracts), and skin lesions (e.g. Café au lait macules) occur. Mutations within the tumor suppressor gene NF2 and their effects on its protein product merlin have been identified over the past years. Recently, novel molecular diagnostic technologies and bioinformatics tools also help us to identify other genes playing a role in tumorigenesis.

Methods: Whole-genome gene expression profiling was performed (HG-U219 Array Plate, Affymetrix®) of tissue samples from 36 patients with sporadic vestibular schwannomas versus seven postmortem samples of the vestibulocochlear nerve. Canonical pathway analysis (Ingenuity Pathway Analysis, IPA) was utilized to determine the most significantly associated pathways. .

Results: A total of 4021 probe sets (2276 probe sets were up- and 1745 downregulated) showed significant difference based on the criteria of P value < 0.01 and log Fold Change of >= 1. With a threshold of 0.0001, IPA identified 13 significantly deregulated canonical pathways. Among them six were involved in categories of the immune response (cytokine signaling, celullar and humoral immune response). We focused on the highest ranked canonical pathway The Role of NFAT in Regulation of the Immune Response which reveals an important role for Nuclear factors of activated T cells (NFAT) and T cell response in the formation of sporadic vestibular schwannoma.

Conclusions: An important role in vestibular schwannoma formation is attributed to pathways and genes of the immune system and there is evidence that these findings may lead to an imbalance between tumorigenesis and immune response. Specifically, Nuclear factors of activated T cells (NFAT) and their transcriptional partners seem to be of potential importance. Nevertheless, results obtained with cDNA microarray analysis require further validation steps by alternative and reliable technologies (e.g. RT-PCR and protein analysis).