Der Einfluss von Phlorizin auf den programmierten Zelltod von Erythrozyten

Abstract

Erythrozyten sind in der Lage, suizidalen Zelltod zu betreiben. Von einigen Substanzen ist bereits bekannt, dass sie die sogenannte Eryptose beeinflussen. Beispiele dafür sind Quecksilber, Monensin, Benzethonium und Oridonin, welche zu den Stimulatoren der Eryptose gehören. Blebbistatin, Koffein und Endothelin, gehören zu den Inhibitoren. In dieser Studie sollte untersucht werden, welchen Einfluss Phlorizin auf den Ablauf des suizidalen Zelltodes von Erythrozyten hat. Es wurde belegt, dass sich Phlorizin unter bestimmten Umständen inhibitorisch auf die Eryptose auswirkt. Reife Erythrozyten weisen im Gegensatz zu den meisten anderen Zellen keinen Zellkern auf. Daher gibt es einige morphologische Unterschiede im Ablauf des suizidalen Zelltods. Typische für die Nachweisbarkeit einer ablaufenden Eryptose wichtige Merkmale sind die erhöhte Phosphatidylserinexposition an der Außenseite der Membran, sowie eine erhöhte zytosolische Kalziumkonzentration mit folgender Zellschrumpfung. Die Phosphatidylserinexposition kann mit Hilfe von FITC-konjugiertem Annexin V durchflusszytometrisch gemessen und verglichen werden. Steht die Zelle unter Energieentzug durch Glukosemangel oder oxidativem Stress, führt dies durch die Bildung von PGE2 zu einer erhöhten Kationenleitfähigkeit, was einen erhöhten Kalziumeinstrom nach sich zieht. Die erhöhte intrazelluläre Kalziumkonzentration kann mittels Fluo-3-AM nachgewiesen werden. Die Anhäufung an intrazellulärem Kalzium führt zu einer Aktivierung kalziumabhängiger Kaliumkanäle, was einen Kaliumausstrom zur Folge hat. Der entstehende elektrische Gradient bewirkt einen Chloridausstrom, wodurch ein osmotischer Gradient entsteht. Dementsprechend strömt Wasser dem Gradienten folgend aus der Zelle, die Zelle schrumpft. Das verminderte Zellvolumen kann durch das Messen des Forward Scatters (FSC) mit dem Durchflusszytometer ermittelt werden. Um den Einfluss von Phlorizin auf den suizidalen Zelltod von Erythrozyten zu überprüfen, wurden folgende Versuche durchgeführt: Zunächst wurden Erythrozyten für 48 h alternativ in Ringer-Lösung (+Glukose) oder glukosefreier Ringerlösung inkubiert. Anschließend wurden die oben genannten Parameter durchflusszytometrisch gemessen. Zusätzlich wurde der Einfluss von Phlorizin auf oxidativ gestresste Erythrozyten untersucht, indem nach 48 h der Inkubation in den genannten Lösungen 0,3 mM t-BOOH hinzugefügt wurde. Außerdem wurde der intrazelluläre ATP-Gehalt der Erythrozyten in den genannten Lösungen bestimmt. Die Versuche wurden jeweils unter dem Einfluss von 0, 10, 50 und 100 µM Phlorizin durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen, dass in glukosehaltiger Ringerlösung sowohl die zytosolische Kalziumkonzentration, also auch die Phosphatidylserinexposition und der FSC der inkubierten Erythrozyten unabhängig von der hinzu gegebenen Phlorizin-Konzentration sind. Erythrozyten unter Glukoseentzug zeigten nach 48 h der Inkubation deutlich erhöhte Werte für den intrazellulären Kalziumgehalt und die Phosphatidylserinexposition sowie einen deutlich verringerten FSC. Diese Effekte wurden teilweise durch die Zugabe von Phlorizin abgeschwächt (Annexin V-Bindung bei Phlorizinkonzentrationen von größer/gleich 10 µM, FSC bei Konzentrationen von größer/gleich 50 µM). Oxidativer Stress erzeugte bei Erythrozyten einen deutlich erhöhten zytosolischen Kalziumspiegel sowie eine erhöhte Phosphatidylserin-exposition. Auch diese Effekte wurden bei der Zugabe von Phlorizin verringert (Fluo-3-AM-Fluoreszenz bei Konzentrationen größer/gleich 50 µM, Annexin V-Bindung bei Konzentrationen größer/gleich 10 µM). Der FSC wurde durch die Zugabe von Phlorizin nochmals signifikant gesenkt, insbesondere in den Konzentrationen von 50 und 100 µM. Der intrazelluläre ATP-Gehalt wurde nach 48 h der Inkubation in den oben genannten Lösungen durch Phlorizin nicht signifikant beeinflusst. Die Beobachtungen lassen sich teilweise durch die Hypothese erklären, dass Phlorizin einen inhibitorischen Effekt auf den apoptotisch bedingten Kalziumeinstrom aufweisen könnte. Dafür spricht die verringerte Zellschrumpfung infolge von Glukoseentzug oder oxidativem Stress unter dem Einfluss von Phlorizin. Eine potentielle Aktivierung von Kaliumkanälen durch Phlorizin könnte erklären, warum es den Effekt von t-BOOH auf das Zellvolumen begünstigt.

Das Ergebnis der Studie belegt, dass Phlorizin einen inhibitorischen Effekt auf den suizidalen Zelltod unter Glukoseentzug stehender und oxidativ gestresster Erythrozyten hat; es nimmt jedoch keinen signifikanten Einfluss auf deren intrazellulären Energiegehalt. Um genaueren Aufschluss über die Interaktionen Phlorizins mit erythrozytären Membrantransportern zu geben, wäre es notwendig, Bindungs-Essays und weitere Versuche auf molekularer Ebene durchzuführen. Es wäre interessant, den Einfluss von Substanzen mit höherem pharmakologischem Potenzial und höherer Bioverfügbarkeit zu testen. In Frage kämen Phloretin oder Phlorizin-Derivate.

Like other cells, erythrocytes are able to commit cellular suicide. Some substances are known to increase or inhibit eryptosis. For example, mercury, monensin, benzethonium and oridonin are potent stimulators of eryptosis, while blebbistatin, caffein and endothelin are inhibitors of eryptosis. The purpose of this study was to investigate the effect of phlorizin on the natural cell death of erythrocytes. The experiments have shown, that phlorizin has an inhibitory effect on eryptosis.

Compared to nearly every other type of human cell, adult erythrocytes do not have a cell nucleus. Thus there are some differences in the morphology of suicidal cell death. Typical markers used for confirmation of ongoing suicidal cell death are an increased exposition of phosphatidylserine on the outer membrane as well as a higher intracellular concentration of calcium, which results in cell membrane scrambling and shrinking of the cell.

The increased exposition of phosphatidylserine as a marker of an increased activity of the erythrocytary scramblase can be verified by using fluorescence activated cell sorting and FITC-conjugated Annexin V. If the cell shows oxidative stress due to glucose depletion, a higher amount of PGE2 is produced. This leads to an increased permeability of cations in the cell membrane causing a larger amount of intracellular calcium. This effect can be detected by using Fluo-3-AM. The increased concentration of intracellular calcium causes the activation of calcium-dependent potassium channels, which then leads to potassium flowing out of the cells. The resulting electric current leads to chloride ions leaving the cell as well. Water then osmotically follows and therefore leads to cell shrinking. The decreased cell volume can be shown comparing the forward scatter.

To analyze the influence of phlorizine on suicidal cell death of erythrocytes, we conducted the following experiments: Incubation of erythrocytes in Ringer solution for 48 h (+glucose), with energy depletion (- glucose), furthermore a following incubation with 0,3 mM t-BOOH for 30 minutes, leading to oxidative stress. Additionally the intracellular amount of ATP has been determined. Each of these experiments has been conducted using phlorizine concentrations of 0, 10, 50 and 100 µM.

The results show that phlorizin does not have an influence on eryptosis in Ringer solution containing glucose. Erythrocytes withdrawn of glucose clearly show higher amounts of intracellular calcium as well as an increased phosphatidylserine exposition and an decreased forward scatter after 48 hours of incubation in an glucose depleted Ringer solution. Phlorizine has been shown to decrease some of these effects (binding of Annexin V at a phlorizine concentration of greater or equal 10 µM, forward scatter at concentration of greater or equal 50 µM). Oxidative stress causes a higher cytosolic calcium level as well as an increased phosphatidyleserine exposition. The addition of phlorizin also decreased these effects (Fluo-3-AM fluorescence at greater or equal 50 µM, binding of Annexin-V at greater or equal 10 µM). The forward scatter has been significantly reduced (at concentrations of phlorizin of 50 µM and 100 µM). The addition of phlorizine did not have a significant effect on intracellular ATP-levels.

The findings can partially be explained by assuming that phlorizine might have an inhibitory effect on apoptically caused calcium flow into erythrocytes. This could be explained by the decreased cell shrinking of erythrocytes caused by oxidative stress or glucose depletion under the influence of phlorizine. The activation of potassium channels by phlorizine could explain the increase of the positive effect of t-BOOH on cell volume.

The study presents phlorizine showing an inhibitory effect on suicidal cell death in erythrocytes under glucose depletion and oxidative stress. It does not show a significant influence on intracellular ATP levels.

To achieve better understanding about interactions between phlorizin and erythrocytal membrane transporters and channels it would be necessary to do binding-essays or to conduct further experiments on molecular levels. It would be interesting, to research the influence on eryptosis of substances that show higher pharmacological potential and higher bioavailability than phlorizine. An interestint substance to investigate would be, for example, phloretine, the aglucon of phlorizine, or other phlorizine derivates.