Entwicklung einer neuen Methode zur ex vivo Quantifizierung der autologen Erythrophagozytose

Abstract

Einleitung: Eine Anämie kann aus einem erhöhten Abbau und einer verminderten Produktion von Erythrozyten (RBC) resultieren. Zur Diagnostik verschiedener Ursachen der Anämie wie der intravasalen Hämolyse oder der Knochenmarksaktivität stehen bereits etablierte direkte und indirekte Messmethoden zur Verfügung. Dagegen war es bislang schwierig, die Erythrophagozytose (EPZ) quantitativ zu erfassen. Methoden: Es wurde daher eine neue Methode zur quantitativen Messung der EPZ entwickelt. Als Phagozyten dienten die autologen Monozyten aus 5 ml Vollblut. Die Separation der CD14+ Monozyten wurde mittels Ficoll-Dichtegradientenzentrifugation und magnetischer Zellsortierung durchgeführt. Die RBC wurden mit dem Fluoreszenzmarker Carboxyfluoreszin Diacetat, Succinimidyl Ester (CFDA-SE) markiert und mit den CD14+ Monozyten für 4 h bei 37 °C inkubiert. Die Phagozytoserate wurde anschließend durchflusszytometrisch gemessen. Nachdem der Assay standardisiert wurde, sollte dessen Validität am Beispiel der schweren Malariaanämie (SMA) gezeigt werden. Bei der Entstehung einer SMA spielt die Phagozytose von parasitierten und nicht- infizierten RBC eine wichtige Rolle. Wir untersuchten acht Patienten mit SMA nach WHO-Definition und stellten ihnen acht gesunde Probanden als Kontrollgruppe gegenüber. Ergebnisse: Während der vierstündigen Inkubationszeit zeigte sich eine konstante Fluoreszenz des Farbstoffs CFDA-SE, eine Kontamination nicht-gefärbter Zellen wurde nicht beobachtet. Die Phagozytoserate der autologen Monozyten war in der SMA-Gruppe signifikant um den Faktor 7,2 im Vergleich zur Kontrollgruppe gesteigert. Schlussfolgerung: CFDA-SE eignet sich gut zur Markierung von RBC und stellt eine Alternative zu den bisher verwendeten Substanzen dar. Der hier vorgestellte Assay ist in der Lage eine klinisch relevante EPZ quantitativ zu messen und zeigt zudem den Zusammenhang der SMA mit einer erhöhten EPZ von nicht-infizierten RBC auf. Die neue Methode ist gut reproduzierbar und bietet wesentliche Vorteile zu den bisherigen Versuchen die EPZ zu bestimmen.

Introduction: Anemia is the net result of decreased redblood cell (RBC) production and increased removal of RBCs. Replication and maturation of erythroid precursors and RBC lysis can be measured by standardized in vitro methods and surrogate markers, respectively. In contrast, erythrophagocytosis by autologous phagocytes is more difficult to quantify. Methods: We developed a method to assess erythrophagocytosis by autologous monocytes from 5 ml of whole blood. RBCs were labeled with carboxyfluorescein-diacetate-succinimidyl ester (CFDA-SE) and subsequently coincubated with autologous CD141 monocytes. Phagocytosis was quantified using flow cytometry. After standardization, the assay was validated in patients with severe malarial anemia (SMA), a condition that is associated with increased erythrophagocytosis. Results: After labeling, CFDA-SE was stably incorporated into RBCs and no significant leakage leading to contamination of nonlabeled cells was observed. Monocytes ingested opsonized, labeled RBCs seven times more than nonopsonized controls. Erythrophagocytosis was significantly higher in SMA than in healthy controls. Conclusions: The established assay showed enhanced autoerythrophagocytosis associated with SMA and hence was able to detect clinically relevant erythrophagocytosis. This novel assay is well suited for rapid quantification of in vitro erythrophagocytosis by autologous monocytes.