Implications of human LRRK2 protein on the regulation of cytoskeleton dynamics in Parkinson's disease

Abstract

Parkinson’s disease (PD) is the most common neurodegenerative movement disorder in the ageing population. Although the vast majority of cases are considered sporadic, around 10-20% is caused by pathogenic missense mutations in PD-associated genes. Among these, mutations in the LRRK2 gene are the most frequent cause of late-onset autosomal-dominant familial but interestingly also sporadic PD. In recent years, over 40 missense variants have been reported in the LRRK2 gene. Of these, only seven have been demonstrated to be pathogenic based upon clear segregation with disease in LRRK2-linked families including N1437H, R1441C/G/H, Y1699C, G2019S, and I2020T. The most prevalent mutation is the G2019S contributing up to 1-2% of sporadic and 7% of familial PD case in Caucasians, and up to 20% of total PD cases in Ashkenazy Jews, or 40% in North African Berbers. Recently, mutations in the LRRK2 gene have been implicated in the dysfunction of several cellular pathways, but still the pathophysiological function of the gene remains unknown. In the present work, a novel LRRK2 transgenic mouse model was generated and characterized in an attempt to elucidate the pathophysiological function of LRRK2. The LRRK2 transgenic mouse model expressed either human wild-type or G2019S LRRK2 protein under the neuron specific Thy1.2 promoter resulting in almost physiological levels of LRRK2 (~2-fold increased protein levels). The characterization of Thy1-2-LRRK2 transgenic mouse model showed expression of LRRK2 protein in affected-PD in brain regions such as cortex, midbrain, and hippocampus. However, the mice did not recapitulate the selective loss of dopaminergic (DA) neurons in substantia nigra pars compacta (SNpc), a major hallmark of postmortem brain from PD patients, suggesting that human LRRK2 protein overexpression, at least at physiological levels, is not sufficient to elicit PD-associated neuropathology. Nevertheless, the current proposed role of LRRK2 acting at the molecular level of different cellular processes suggests the use of Thy1.2-LRRK2 transgenic mouse model as a valuable tool to study the pathophysiological function of human LRRK2 and pathogenic-LRRK2 mutations in those cellular processes. One specific question addressed in the present work was to further explore the role of human LRRK2 protein regulating actin cytoskeleton dynamics in neurite outgrowth in Thy1.2-LRRK2 transgenic mice, and cellular adhesion and locomotion in human fibroblasts. Previous evidence suggested a potential role of LRRK2 regulating actin and microtubule cytoskeleton dynamics as a mechanism underlying LRRK2-associated PD pathology. In this study, primary hippocampal cultures derived from Thy1.2-LRRK2 transgenic mice exhibited reduced neurite outgrowth and arborization in human WT LRRK2 neurons whereas no alterations were observed in G2019S LRRK2 compared to non-transgenic neurons, suggesting that two different regulatory mechanisms may be involved regulating neurite outgrowth and arborization. In addition, primary human skin fibroblasts derived from LRRK2-PD patients and healthy subjects were analyzed for cellular adhesion and locomotion, however, no alterations were observed in LRRK2-PD fibroblasts compared to WT LRRK2 fibroblasts. To investigate the role of LRRK2 kinase activity regulating actin cytoskeleton dynamics in those processes, cells were treated with the specific LRRK2 kinase inhibitor LRRK2-IN-1. Inhibition of LRRK2 kinase activity resulted in increased neurite outgrowth and arborization only in G2019S-LRRK2 neurons, and in alterations in cellular adhesion in fibroblast, but not in cellular locomotion, except in I2020T-LRRK2 fibroblasts. These results suggest that interaction between mutated LRRK2 kinase and LRRK2-IN-1 may be different to WT LRRK2 possible by altering interaction partner or changing LRRK2 properties. In summary, the present study supports the involvement of physiological expression levels of human LRRK2 in the regulation of actin cytoskeleton arrangements and dynamics in neurite outgrowth but not in cellular adhesion and locomotion. This work also shows that inhibition of LRRK2 kinase activity modulates actin cytoskeleton dynamics in neurite outgrowth and cellular adhesion only in cells carrying the G2019S and I2020T LRRK2 kinase mutations. Altogether, these results suggest a physiological function of LRRK2 in the regulation of actin cytoskeleton arrangements and/or dynamics that dependents on LRRK2 kinase activity.

Die Parkinson Erkrankung ist die häufigste neurodegenerative Bewegungsstörung in der alternden Bevölkerung. Obwohl die erhebliche Mehrheit der Fälle als sporadisch erachtet wird, sind ca. 10-20% der Fälle durch krankheitsverursachende Missense Mutationen in Parkinson-assoziierten Genen verursacht. Unter diesen sind Mutationen im LRRK2 Gen die häufigste Ursache für spät beginnendes autosomal dominantes familiäres Parkinson, aber interessanterweise auch für die sporadische Form. In den letzten Jahren wurden über 40 Missense Varianten im Gen LRRK2 identifiziert. Von diesen konnten nur sieben, die N1437H, R1441C/G/H, Y1699C, G2019S und I2020T, durch klare Segregation mit der Krankheit in LRRK2-gekoppelten Familien als krankheitsverursachend nachgewiesen werden. Die am häufigsten vorkommende Mutation ist die G2019S, welche in bis zu 1-2% der sporadischen und in 7% der familiären europäischen Parkinson Fälle vorkommt, sowie in bis zu 20% aller Parkinson Fälle in aschkenasischen Juden und in 40% der nordafrikanischen Berbern. Kürzlich sind Mutationen im LRRK2 Gen mit der Fehlfunktion von einigen zellulären Abläufen in Verbindung gebracht worden, aber die pathophysiologische Funktion des Gens bleibt immer noch unbekannt. In der vorliegenden Studie wurde ein neues transgenes LRRK2 Maus Modell generiert und charakterisiert, in dem Versuch die pathophysiologische Funktion von LRRK2 aufzuklären. Das transgene LRRK2 Maus Modell exprimierte entweder humanes Wildtyp oder G2019S LRRK2 Protein unter dem Neuronen-spezifischen Thy1.2 Promoter, was zu einem fast physiologischen LRRK2-Level führte (~zweifach erhöhter Protein-Level). Die Charakterisierung des transgenen Thy1.2-LRRK2 Maus Modells zeigte eine Expression von LRRK2 Protein in den von Parkinson betroffenen Gehirnregionen (Kortex, Mittelhirn und Hippocampus). Allerdings zeigten die Mäuse nicht den selektiven Verlust von dopaminergen Neuronen in der substantia nigra pars compacta (SNpc), welcher das Hauptmerkmal in post-mortem-Gehirn von Parkinson Patienten ist. Dies weist darauf hin, dass die Überexpression von humanem LRRK2 Protein, zumindest bei physiologischen Mengen, nicht ausreicht, um eine Parkinson-assoziierte Neuropathologie hervorzurufen. Nichtsdestotrotz, die derzeitig vorgeschlagene Rolle von LRRK2, in der es auf molekularer Ebene auf verschiedene zelluläre Prozesse einwirkt, deutet daraufhin, dass die Benutzung des transgenen Thy1.2-LRRK2 Maus Modells ein nützliches Werkzeug zur Erforschung der pathophysiologischen Funktion von humanem LRRK2 und pathogenen LRRK2 Mutationen in diesen zellulären Prozessen ist. Eine Fragestellung der vorliegenden Studie war, die Rolle von humanem LRRK2 Protein, welches die Dynamik des Neuriten-Auswuchs reguliert, weiter in transgenen Thy1.2-LRRK2 Mäusen zu untersuchen, sowie die zelluläre Adhäsion und die Fortbewegungsfähigkeit in humanen Fibroblasten zu erforschen. Vorherige Studien deuten darauf hin, dass LRRK2 in der Regulierung von Aktin und den Mikrotubuli-Zytoskelett-Abläufen als ein Mechanismus eine Rolle spielt, der der LRRK2-assoziierten Parkinson Pathologie zu Grunde liegt. In der vorliegenden Studie zeigten primär hippocampale Kulturen, die von transgenen Thy1.2-LRRK2 Mäusen stammten, einen reduzierten Neuriten-Auswuchs und eine verminderte Neuriten-Verzweigung in humanen Wildtyp LRRK2-Neuronen, wobei keine Veränderungen in G2019S LRRK2 verglichen mit nicht-transgenen Neuronen beobachtet werden konnten. Dies deutet auf zwei verschiedene regulatorische Mechanismen hin, die möglicherweise in die Regulierung von Neuriten-Auswuchs und –Verzweigung involviert sind. Des Weiteren wurden primäre Hautfibroblasten, die von LRRK2-Parkinson Patienten und gesunden Probanden stammten, hinsichtlich zellulärer Adhäsion und Fortbewegungsfähigkeiten untersucht. Es konnten jedoch keine Veränderungen in LRRK2-Parkinson Fibroblasten verglichen mit Wiltyp-LRRK2 Fibroblasten festgestellt werden. Um die Rolle der LRRK2 Kinase Aktivität, welche die Aktin-Zytoskelett Dynamik in diesen Prozessen reguliert, zu untersuchen, wurden die Zellen mit einem spezifischen LRRK2 Kinase Inhibitor, LRRK2-IN-1, behandelt. Diese Hemmung der LRRK2 Kinase Aktivität resultierte in gesteigertem Neuriten-Auswuchs und –Verzweigung nur in G2019S-LRRK2 Neuronen, und führte auch zu Veränderungen der zellulären Adhäsion in Fibroblasten, allerdings nicht in der zellulären Fortbewegungsfähigkeit, außer in I2020T-LRRK2 Fibroblasten. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Interaktion zwischen mutierter LRRK2 Kinase und LRRK2-IN-1 anders sein könnte als mit Wildtyp LRRK2, möglicherweise durch das Verändern der Interaktionspartner oder durch das Abändern der Eigenschaften von LRRK2.