Immuncytochemische Differenzierung von Schleimhaut- und Hautzellen an forensischen Spuren

Abstract

Die vorliegende Doktorarbeit beschreibt eine neu entwickelte Methode zur immuncytochemischen Identifizierung von Schleimhautzellen in forensischen Spuren.

Zunächst wurden aus der Vielzahl an Cytokeratinen und den entsprechenden Antikörpern diejenigen identifiziert, die spezifisch für Schleimhautepithelzellen sind. Der nächste Schritt bestand in der Modifikation der immunhistochemischen Färbeprotokolle, die ursprünglich für Gewebeschnitte konzipiert waren, für den Einsatz an cytologischen Präparaten. Zudem mussten geeignete Fixations- und Permeabilisationsverfahren gefunden und angepasst werden. In einer Vielzahl von Vorversuchen kristallisierte sich für den forensischen Einsatz Cytokeratin 4 als schleimhautspezifischer Zellbestandteil heraus. Mit CytoRich Red konnte eine geeignete Fixationslösung gefunden werden. Die Verwendung von Trypsin zur Permeabilisierung der cytologischen Präparate führte zu ausgezeichneten Färberesultaten, ohne die morphologische Integrität der Zellen zu beeinträchtigen. Mittels der entwickelten Färbetechnik gelang es erstmals, menschliche Schleimhautzellen in forensischen Spuren sicher zu identifizieren.

Die gemäß den entwickelten Vorschriften gefärbten Zellen konnten in einem nächsten Schritt mittels Laser-Mikrodissektion selektiv gewonnen werden. Es gelang in mehreren Stichproben die Erstellung einer DNA-Typisierung, dem sogenannten „genetischen Fingerabdruck“.

Schließlich gelang es mittels Real-Time-quantitative-PCR Unterschiede in der relativen Expression von Cytokeratin 4 zwischen Vaginal- und Wangenschleimhaut festzustellen. Dieser Ansatz stellt einen ersten Schritt zur eindeutigen Unterscheidung der beiden Schleimhaut-Typen dar, was einen weiteren Mosaikstein in der Auswertung biologischer Spuren darstellen kann.

This doctoral thesis describes a newly developed method for the identification of mucous cells in forensic traces by means of immunocytochemical staining.

Among the variety of cytokeratins that exist in human cells, it was possible to find a few which were specific for mucosa. Subsequently, existing immunohistochemical staining protocols which were initially designed for tissue sections were modified for use on cytological preparations. In addition, suitable procedures for fixation and permeabilization had to be found and adjusted.

In a large number of preliminary tests, cytokeratin 4 (CK4) emerged as a cell component specific for mucous cells suitable for forensic use.

In CytoRich Red a suitable fixation solution could be found. The use of trypsin for permeabilization resulted in excellent staining results without compromising the morphological integrity of the cells.

By means of the developed staining method, it was possible for the first time to reliably identify human mucous cells in forensic samples.

As a next step, those cells that were stained according to the newly developed protocols could be obtained via laser microdissection. In a number of sample tests, it was possible to realise a DNA-typing from the thus obtained cells.

Finally, differences in the relative expression of cytokeratin 4 between vaginal and buccal mucosa could be found via real-time quantitative PCR. This approach constitutes a first step towards a clear distinction of the two kinds of mucosa, which can added to the mosaic of forensic trace analysis.