Entwicklung eines Western-Blot-Verfahrens zur semiquantitativen Bestimmung der Antikörperkonzentration gegen den Malariaimpfstoffkandidat GMZ2 - ein MSP3-GLURP-Fusionsprotein

Abstract

Malaria ist eine der wichtigsten parasitären Erkrankungen in den Tropen und Subtropen, die etwa 50% der Weltbevölkerung betrifft. Plasmodium falciparum, der Erreger der Malaria tropica, stellt die gefährlichste Variante dar. In dieser Arbeit wurde eine semiquantitative Bestimmung der IgG-Konzentration gegen GMZ2, ein Fusionsprodukt aus zwei Antigenen des P. falciparum, durch eine Messung mit dem Western Blot-Verfahren entwickelt. Als Referenzmethoden wurden die etablierten Messverfahren ELISA und ELISPOT verwendet. Mittels linearer Korrelation und einer Bland-Altman-Analyse wurden die erhobenen Werte sowie die Veränderungen der Werte über die Zeit verglichen, um zu ermitteln, ob das Western-Blot-Verfahren neue Informationen über die Immunreaktion im Rahmen einer Impfung gegen Malaria liefern kann. Im Western Blot zeigten sich Antikörper gegen Bruchteile des Antigens GMZ2. Der größte Anteil der Antikörper wurde gegen ein Protein einer Größe von 260 kDa gebildet. An Tagen einer stärkeren Immunreaktion gegen das Antigen GMZ2 wurden Antikörper gegen kleinere Fragmente des Antigens nachgewiesen. Bei der Bland-Altman-Analyse fiel ein starker signifikanter Zusammenhang des ELISA mit dem Western Blot auf (Algorithmus 1: r = 0,713, Wahrscheinlichkeit > |t| <0,0001*, Algorithmus 3: r = 0,613, Wahrscheinlichkeit > |t| <0,0001*). Die lineare Korrelation der Werte des Western Blot mit denen des ELISPOT war geringer aber ebenfalls signifikant (Algorithmus 1: r = 0,552, p <0,0001*, Algorithmus 3: r = 0,426, p <0,0001*). Und auch die Korrelation des ELISA mit dem ELISPOT war mittelstark und signifikant (r = 0,571, 95%-KI: 0,4-0,7, p <0,0001*). Bei der paarweisen Korrelation der Differenz vom Tag 0 zum Tag 84 fiel ein signifikanter Zusammenhang zwischen ELISA und dem Algorithmus 1 des Western Blot auf (r = 0,857, p <0,0001*). Beim Vergleich der Veränderung von Tag 84 auf Tag 365 im Algorithmus 1 des Western Blot beziehungsweise ELISA mit dem ELISPOT war eine mittelstarke Korrelation nachweisbar, die jedoch nicht signifikant war (Algorithmus 1 des Western Blot: r = 0,532, p = 0,019, ELISA: r = 0,656, p = 0,0023). Es wurde gezeigt, dass das Western-Blot-Verfahren semiquantitativ zum Nachweis von Antikörpern gegen das Antigen GMZ2 verwendet werden kann. Über eine deutliche Korrelation mit den Werten des ELISA und einer teilweisen Korrelation mit den Werten des ELISPOT hinaus, bietet das Verfahren neue Informationen, da unter anderem Antikörper gegen Bruchstücke des Antigens gezeigt werden können. Auch besteht die Möglichkeit, dass anhand des Western Blot Aussagen über eine dauerhafte Immunität getroffen werden können.

Malaria is one of the most important parasitic diseases in the tropics and subtropics, concerning about 50% of the world population. Plasmodium falciparum, the pathogenic agent of falciparum malaria, is the most dangerous type. In the present dissertation a semiquantitative determination of the IgG concentration against GMZ2, a fusion protein from two Plasmodium falciparum antigens, was developed by measurement with the Western blot method. The established measuring techniques ELISA and ELISPOT were used as reference methods. The collected data as well as the change of the data over time were compared by linear correlation and a Bland-altman-analysis to determine, whether the Western blot provided new information about the immune reaction after a vaccination against malaria. The Western blots showed antibodies against fractions of the antigen GMZ2. The biggest amount of antibodies was detected against a protein of the size of 260 kDa. On the days of a stronger immune reaction against the antigen GMZ2 antibodies against smaller fragments of the antigen were detected. A strong significant correlation between ELISA and Western blot was shown with the Bland-Altman-analysis (algorithm 1: r = 0,713, probability > |t| <0,0001*, algorithm 3: r = 0,613, probability > |t| <0,0001*). The linear correlation between the Western blot data and the ELISPOT data was lower but also significant (algorithm 1: r = 0,552, p <0,0001*, algorithm 3: r = 0,426, p <0,0001*). The correlation between ELISA and ELISPOT was moderate and significant (r = 0,571, 95%-KI: 0,4-0,7, p <0,0001*). A significant correlation of the difference from day 0 to day 84 between ELISA and the algorithm 1 of the Western blot was shown (r = 0,857, p <0,0001*). A comparison of the changes from day 84 to day 365 showed a moderate non-significant correlation between the algorithm 1 of the Western blot and the ELISPOT as well as the ELISA and the ELISPOT (algorithm 1 of the Western blot: r = 0,532, p = 0,019, ELISA: r = 0,656, p = 0,0023). It was shown that the Western blot method can be used for a semiquantitative detection of antibodies against the antigen GMZ2. Beyond a considerable correlation with the data of the ELISA and a partly correlation with the data of the ELISPOT the method offers new information, as among other things antibodies against fractions of the antigen can be detected. Furthermore it might be possible to make a statement about a lasting immunity on the basis of the data acquired by Western blot.