Aufnahmemechanismus von Hitzeschockprotein:Antigen-Komplexen bei der MHC II-vermittelten T-Zellreaktion

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URI: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:21-opus-63541
http://hdl.handle.net/10900/45995
Dokumentart: Dissertation
Date: 2012
Language: German
Faculty: 4 Medizinische Fakultät
Department: Medizin
Advisor: Dannecker, Günther (Prof. Dr.)
Day of Oral Examination: 2009-11-26
DDC Classifikation: 610 - Medicine and health
Keywords: Hitzeschock-Proteine , Endocytose
Other Keywords: T-Zellaktivierung , HLA-DM , MHC II
Heat shock protein , T cell activation , Endocytosis
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Inhaltszusammenfassung:

Die eingereichte Arbeit untersuchte in einem humanen, antigenspezifischen System die forcierte CD4+ T-Zellaktivierung mit Hitzeschockprotein (Hsp) 70-komplexierten Antigenen. CD4+ T-Zellen von HLA-typisierten und gegen Influenza oder Tetanus immunisierten Spendern wurden mit Peptiden oder Hsp:Peptid-Komplexen aus dem Tetanustoxoid oder Influenza-Hämagglutinin stimuliert. Anzahl und Proliferation antigenspezifischer T-Zellen wurden nach 6-10 Tagen mittels CD4+ und HLA-DR-Tetramerfärbung durchflusszytometrisch bestimmt. Die Reaktion antigenspezifischer T-Zellen wurde auf Stimulation mit Peptiden als auch ganzem Tetanus-Toxoid Protein mit und ohne Hsp70-Komplexierung untersucht. Es zeigte sich bei Verwendung des Proteins eine ähnliche Proliferationsverstärkung wie mit Peptid. Ein Teil der proliferierten Zellen konnte durch MHC II-Tetramer Färbung als spezifisch für ein Peptidfragment des Proteins nachgewiesen werden. Daraufhin wurde die mögliche Aufnahme der Hsp:Peptid-Komplexe und deren Mechanismus näher untersucht. Hierzu wurden verschiedene Aufnahmemechanismen der antigenpräsentierenden Zellen (APZs) mittels reduzierter Temperatur oder einer Quervernetzung der Membran durch Paraformaldehyd (PFA) geblockt bzw. es erfolgte eine Inkubation der APZs mit endozytoseblockierenden Chemikalien (Cytochalasin D, Genistein und Chloroquine). Dies resultierte in einem signifikanten Rückgang der Proliferation antigenspezifischer CD4+ T-Zellen sowohl bei Stimulation mit Peptid als auch mit Hsp:Peptid-Komplexen. Eine intakte Funktion der Aktinpolymerisierung, der Tyrosinkinasen sowie der endosomalen Proteolyse ist Bedingung für die Hsp70-verstärkte CD4+ T-Zellproliferation. Blockadeversuche eines beschriebenen Endozytoserezeptors mit einem Antikörper zeigten, dass CD91 möglicherweise der Rezeptor für diesen Mechansimus ist. Die Daten indizieren, dass antigene Peptide mittels Hsp70 erleichtert die endosomalen Kompartimente über Rezeptor-vermittelte Endozytose erreichen, in denen MHC II-Moleküle beladen werden. Bei Verwendung einer für das HLA-DM Molekül negativen Zelllinie als antigenpräsentierende Zellen zeigte sich, dass Hsp70 nicht die stabilisierende Funktion von HLA-DM bei der Peptidbeladung auf MHC II-Moleküle übernehmen kann. So konnte der Mechanismus der Hsp70-vermittelten CD4+ T-Zellaktivierung weiter aufgeklärt werden. Dies könnte insbesondere bei der Behandlung von Autoimmunerkrankungen wie etwa der juvenilen rheumatoiden Arthritis interessant sein. Durch Einflussnahme an diesen Mechanismen wäre eine Regulation des immunmodulierenden Effektes von HSP denkbar.

Abstract:

This work is investigating the enhanced CD4+ T-cell activation by antigenic peptides complexed to heat shock protein 70 (Hsp70) in a human, antigen-specific system. Stimulation of CD4+ memory T-cells was induced using antigens from tetanus toxin or influenza hemagglutinin either the peptide epitopes alone or with the peptide complexed to Hsp70. The HLA-DR-typed healthy cell donors were immunized against tetanus or influenza. Number and proliferation of antigen specific T-cells were measured 6-10 days after stimulation using the dilution of the fluorescent-dye CFSE and with peptide-loaded HLA-DR-tetramers. The reaction of antigen specific T-cells was evaluated after stimulation with peptides as well as the whole tetanus toxoid with or without complexation to Hsp70. We found enhancement of the CD4+ T-cell activation by the whole tetanus toxoid protein chaperoned to Hsp70 comparable to the effect seen by the peptide epitopes. By using MHC II-tetramer staining the proliferated cells could be identified for being specific of a peptide epitope oft he protein. Blocking of possible endocytosis mechanism could be achieved by pre-treating the antigen presenting cells (APCs) with chemical reagents or varying temperatures during incubation with the antigens. Fixation of the cells with paraformaldehyde (PFA) and blocking of the endocytosis via cytochalasin D, genistein and chloroquine resulted in a significant decline of generating specific T-cells in both, stimulation with peptide alone or complexed to Hsp. Blocking the endocytosis inhibits the enhancement of the activation and proliferation CD4+ T-cells. Blocking of the possible endocytosis receptor by using an antibody showed CD91 as possible receptor of this mechanism. These results argue for an internalization of the hsp70:antgen complexes by APCs and uptake into the endosomal vesicles for presentation by MHC II. Using a B-cell line with a knocked out DM-molecule we could not demonstrate the same activation as in the DM positive line, indicating that Hsp70 may not replace HLA-DM in stabilisation of MHC II-molecules during peptide loading.

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