Identifizierung von neuen CD8+ T-Zell-Epitopen aus dem Tumorantigen Zytokeratin 7

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URI: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:21-opus-63355
http://hdl.handle.net/10900/45993
Dokumentart: Dissertation
Date: 2012
Language: German
Faculty: 4 Medizinische Fakultät
Department: Medizin
Advisor: Rammensee, Hans-Georg (Prof. Dr.)
Day of Oral Examination: 2011-04-21
DDC Classifikation: 610 - Medicine and health
Keywords: Immuntherapie , Bauchspeicheldrüsenkrebs , Tumorantigen , Keratine , Epitop
Other Keywords: Pankreaskarzinom , Zytokeratin 7 , CD8+ T-Zell-Epitop
Immunotherapy , Pancreatic adenocarcinoma , Tumor antigen , Cytokeratin 7 , CD8+ T-cell-epitope
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Inhaltszusammenfassung:

Große Fortschritte in der Tumorimmunologie über die letzten ein bis zwei Dekaden ermöglichen die Erwägung der Krebsimmuntherapie als ernsthafte Ergänzung des onkologischen Behandlungsspektrums für unterschiedlichste Malignomentitäten. Trotz vieler Rückschläge und weiter bestehender Herausforderungen sind doch einige Ansätze – vor allem Antikörper – schon klinisch etabliert. Aktive Immunisierungen befinden sich noch in klinischen Studien, die bisher, auch für das Pankreaskarzinom, unterschiedlichen Vakzinationen generell Sicherheit und in einigen Patienten Induktion von Immunantworten attestieren, welche nicht selten mit verlängertem Überleben korrelieren. Motivation zu vorliegender Arbeit nährte sich aus dem Los eines chirurgisch und chemotherapeutisch erschöpfend therapierten noch sehr jungen Patienten mit histologisch atypischem, duktalem Pankreaskarzinom, für den ein Heilversuch per Tumorimpfung gewagt worden war. Die Immunhistochemie des malignen Gewebes empfahl das stark überexprimierte Zytokeratin 7 (CK7) als zusätzliches Tumorantigen. Nun sollten aus diesem Protein neue CD8+ T-Zell-Epitope identifiziert werden um sie als Peptide zur Vakzinierung zur Verfügung stellen zu können. Einer in silico-Prädiktion anhand des Vorhersagetools „SYFPEITHI“ von HLA-A*0201- bzw. HLA-B*5101-restringierten, wahrscheinlichen Epitopen folgte eine in vitro-Verifikation dieser Peptide: Aus Monozyten erzeugte, mit synthetischem Peptid beladene dendritische Zellen gesunder Spender fungierten als aktivierende, professionelle antigenpräsentierende Zellen für eine gesuchte, naive, peptidspezifische CD8+ T-Zelle im Lymphozytenpool des identischen Spenders. Nach repetitiver Stimulation und Proliferation erfolgte die Analyse der Kultur auf eine distinkte spezifische Population über intrazelluläre IFNgamma-Färbung. Zum Nachweis der endogenen Prozessierung und Präsentation der untersuchten Epitopkandidaten sowie der zytotoxischen Kapazität der erzeugten Effektorpopulation waren Tumorzelllyseexperimente geplant. Von den acht bzw. zehn HLA-A*0201- bzw. HLA-B*5101-restringierten vorhergesagten Kandidaten erwiesen sich in neunzehn verschiedenen untersuchten Leukozytenspenden jeweils zwei als immunogen und konnten distinkte peptidspezifisch IFNgamma-produzierende CD8+-T-Zellpopulationen, teilweise in mehreren, unterschiedlichen Spenden induzieren: RLAGDGVGAV, CK7 402-411 und TLNETELTEL, CK7 227-236 (HLA-A*0201-restringiert) sowie DGVDAVNI, CK7 406-413 und TAAENEFVV, CK7 188-198 (HLA-B*5101-restringiert) sind somit als hochkarätige Epitopkandidaten identifiziert. Lediglich der Nachweis ihrer natürlichen Prozession und Präsentation steht noch aus. Die Zytotoxizitätsexperimente konnten bisher aufgrund leider erfolgloser – obwohl umfangreicher – HLA-Transfektionsbemühungen einer potentiell geeigneten Zielzelle, der Pankreaskarzinomzelllinie Capan-1, noch nicht angeschlossen werden. Zukünftige Zytotoxizitäts-assays und die Evaluation der spontanen in vivo-Relevanz dieser vier Epitopkandidaten in Patienten mit Zytokeratin 7 überexprimierenden Tumoren sollten diese Lücke jedoch schließen können und den Weg zum Einsatz als Vakzine bei Pankreaskarzinomen aber auch anderen Entitäten bereiten. Bedauerlicherweise konnte unser Patient nicht mehr wie erwünscht von der Impfung profitieren.

Abstract:

Marked progress over the past two decades in tumor immunology supplies rationale for sincere consideration of immunotherapy as complementary approach in treatment for diverse tumor entities. In spite of numerous defeats and many persisting challenges, some strategies like monoclonal antibodies are already established in clinical routine. Up to now still object of (pre-)clinical studies are active immunizations: Diverse protocols including several for treatment of pancreatic carcinoma generally attest safety and in some cases and patients also show induction of a specific immune response which not rarely correlates with improved survival. Motivation for the reported work had its source in the fate of a still quite young patient suffering from a histologically rare and atypical pancreatic adenocarcinoma. Surgery and chemotherapy had approached their limits and complementary active immunization was hopefully embraced as a last resort. Immunohistochemistry of the specimen recommended the highly overexpressed intermediate filament Cytokeratin 7 (CK7) as additional tumor antigen and vaccination target. Aim of the present study was the identification of novel CD8+ T-cell-epitopes emerging from this protein, providing immunogen peptides for vaccination: Following in silico prediction with the SYFPEITHI-tool, in vitro verification of highly likely HLA-A*0201- and HLA-B*5101-restricted epitopes was aspired. Monocyte-derived, synthetic peptide pulsed Dendritic Cells from healthy donors functioned as activating professional Antigen Presenting Cells for the wanted naive and peptide-specific CD8+ T-cell in the PBMC-lymphocyte-pool of the identic donor. After priming, repetitive stimulation and proliferation, cultures were analyzed for distinct specific populations, mainly by IFNgamma- Intracellular Cytokine Staining. Tumor cell lysis assays were planned for proof of endogenous processing and presentation of the studied epitope candidates as well as the generated effector-populations' cytotoxic capacity. Out of eight and ten HLA-A*0201- and HLA-B*5101-restricted predicted candidates respectively, in nineteen leukocyte donations two in each case proved immunogenicity and were able to induce distinct peptide-specific IFNgamma-producing CD8+-T-cell-populations: Hence RLAGDGVGAV, CK7 402-411 and TLNETELTEL, CK7 227-236 (HLA-A*0201-restricted) as well as DGVDAVNI, CK7 406-413 and TAAENEFVV, CK7 188-198 (HLA-B*5101-restricted) are now identified as epitopes. Simply proof of natural processing and presentation is pending. Because of - up to this point - unsuccessful endeavors to HLA-transfect the CK7-overexpressing pancreatic carcinoma cell line Capan-1, cytotoxicity assays could not yet be performed. Future tumor cell killing-experiments and evaluation of spontaneous in vivo responses to these four epitopes in patients with CK7-overexpressing tumors should bridge this gap and path the way to an application as vaccine in pancreatic carcinoma as well as in a variety of different entities. Regrettably our patient could not profit any more from the desired vaccination.

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