Auswirkungen einer reduzierten Klotho-Genexpression bei Mäusen

Abstract

Klotho ist ein Protein, das hauptsächlich in den Epithelkörperchen, im distalen Tubulus der Niere und im Plexus choroideus gebildet wird. Es kann sowohl als Membranprotein vorliegen als auch ins Blut oder in den Liquor sezerniert werden. Klotho wirkt durch seine vielfältige Funktionen der Alterung entgegen. Unter anderem hemmt es gemeinsam mit FGF23 die Bildung von 1,25-Dihydroxyvitamin D3. Darüber hinaus nimmt Klotho an der Regulation der renalen tubulären Phosphatreabsorption teil und stimuliert die renale tubuläre Ca2+-Reabsorption. Mäuse mit einer reduzierten Klotho-Genexpression leiden an einem schweren Wachstumsdefizit und einer enorm verkürzten Lebensspanne. Außerdem weisen sie massiv erhöhte Calcitriolkonzentrationen im Plasma auf. Die Auswirkungen der Klothodefizienz können durch diätetische Vitamin-D-Restriktion weitestgehend aufgehoben werden. Vitamin D3 stimuliert in einer Vielzahl von Zellen den Ca2+-Einstrom. Dieser triggert jedoch in Erythrozyten deren suizidalen Zelltod, die Eryptose. Charakteristische Zeichen dafür sind Zellschrumpfung und Phosphatidylserinexposition an der Zelloberfläche. Die vorliegende Arbeit untersucht mögliche Auswirkungen eines Klothomangels auf die Eryptose. Anhand der Fluo3-Fluoreszenz konnte eine signifikant höhere intrazelluläre Ca2+-Konzentration von Klothokl/kl-Erythrozyten im Vergleich zu Klotho+/+-Erythrozyten festgestellt werden. Auch der Anteil Annexin-V-bindender Erythrozyten, der die Phosphatidylserinexposition an der Zelloberfläche repräsentiert, war bei Klothokl/kl-Mäusen signifikant höher. Die Messung des Forward Scatter ergab ein signifikant reduziertes Zellvolumen von Klothokl/kl-Erythrozyten im Vergleich zu Klotho+/+-Erythrozyten. Damit konnte eine Stimulation der Eryptose durch Klothomangel gezeigt werden. Auf einen erhöhten Erythrozytenumsatz deutete der bei Klothokl/kl-Mäusen signifikant höhere Retikulozytenanteil hin. Vitamin-D-arme Diät führte zu einer Normalisierung des Ca2+-Einstroms und der Annexin-V-Bindung von Klothokl/kl-Erythrozyten. Die Ergebnisse weisen also auf eine neue Funktion von Klotho hin, nämlich die zumindest teilweise Vitamin-D-abhängige Regulation des Ca2+-Einstroms in Erythrozyten und der Eryptose. Darüber hinaus wurden in der vorliegenden Arbeit die Auswirkungen eines Klothomangels auf den Mineralstoff- und Elektrolythaushalt untersucht. Dazu wurden mit Vitamin-D-haltiger Kontrolldiät behandelte Wildtyp-Mäuse (Klotho+/+D+) und Klotho-defiziente Mäuse, die Vitamin-D-haltige Kontrolldiät (Klothokl/klD+), Vitamin-D-arme Diät (Klothokl/klD-) oder während der ersten vier Lebenswochen Vitamin-D-arme Diät und anschließend Vitamin-D-haltige Kontrolldiät (Klothokl/klD-/+) erhielten, miteinander verglichen. Die Plasmakonzentrationen von 1,25(OH)2D3, ACTH (Adenocorticotropes Hormon), Aldosteron und AVP (Argininvasopressin) waren bei Klothokl/klD+-Mäusen signifikant höher als bei Klotho+/+D+-Mäusen. Entsprechendes war für die Plasmakonzentrationen von Ca2+, Phosphat und Na+ zu beobachten. Die K+-Konzentrationen waren nicht verschieden zwischen den Gruppen, während die Plasmaosmolalität und die Harnstoffkonzentration im Plasma von Klothokl/klD+-Mäusen signifikant erhöht waren im Vergleich zu den Werten der Klotho+/+D+-Mäuse. Demgegenüber stand ein bei Klothokl/klD-/+-Mäusen im Vergleich zu Klotho+/+D+-Mäusen signifikant erniedrigter Blutdruck. Die Ergebnisse weisen damit auf einen durch Volumenmangel bedingten sekundären Hyperaldosteronismus der Klotho-defizienten Mäuse hin. Durch Vitamin-D-arme Diät konnten die Unterschiede größtenteils aufgehoben werden. Die Ussing-Kammer-Experimente belegten einen erhöhten Amilorid-sensitiven Strom entlang des Kolonepithels und deuteten somit auf eine erhöhte epitheliale Na+-Kanalaktivität (ENaC) bei Klothokl/klD+-Mäusen hin. Die vorliegenden Beobachtungen zeigen also, dass die exzessive Calcitriolsynthese bei Klotho-defizienten Mäusen nicht nur den Mineralstoff- sondern auch den Flüssigkeits- und Elektrolythaushalt beeinflusst.

Klotho is a protein mainly produced in the parathyroid glands, in the distal convoluted tubules of the kidney and the choroid plexus. It can function as a membrane protein or it can be secreted into blood or cerebrospinal fluid. Klotho counteracts aging by its various functions. It participates in the inhibitory effect of FGF23 on the formation of 1,25(OH)2D3. Furthermore it takes part in the regulation of renal tubular phosphate reabsorption and stimulates renal tubular Ca2+ reabsorption. Klotho-hypomorphic mice suffer from increased calcitriol concentrations in plasma, severe growth deficit and an extremely reduced life span, effects largely reversed by Vitamin-D-deficient diet. Vitamin D3 stimulates Ca2+ entry in a variety of cells. In erythrocytes increased Ca2+ entry stimulates eryptosis, the suicidal erythrocyte death, which is characterized by cell shrinkage and phosphatidylserine exposure at the cell surface. The present study explores the possible effects of Klotho on eryptosis. With the aid of Fluo3 fluorescence it could be observed that intracellular Ca2+ concentration was significantly larger in klothokl/kl erythrocytes than in klotho+/+ erythrocytes. Annexin V-binding which represents phosphatidylserine exposure on the cell surface was also significantly enhanced in klothokl/kl erythrocytes. The measurement of forward scatter revealed a significantly smaller cell volume of klothokl/kl erythrocytes compared to klotho+/+ erythrocytes. These observations show that eryptosis is stimulated in the erythrocytes of Klotho-deficient mice. Reticulocyte number was significantly increased in klothokl/kl mice, pointing to enhanced erythrocyte turnover. Vitamin D-deficient diet lead to normalisation of the enhanced Ca2+ entry and annexin V-binding of klothokl/kl erythrocytes. These results reveal a novel function of Klotho, that is to say an at least partially vitamin D-dependent regulation of cytosolic Ca2+ activity in erythrocytes and their suicidal death. Moreover the present study explores the role of Klotho-deficiency on mineral and electrolyte metabolism. For this purpose Klotho-deficient (klothokl/kl) mice and wild type mice (klotho+/+) were fed different diets and compared to each other. They received Vitamin-D-containing control diet (D+) or Vitamin-D-deficient (D-) diet or Vitamin-D-deficient diet for their first 4 weeks of life followed by control diet (D-/+). At the age of 8 weeks, body weight was significantly smaller in klothokl/klD+ mice than in klotho+/+D+ mice, klothokl/klD- mice and klothokl/klD-/+ mice. Plasma concentrations of 1,25(OH)2D3, ACTH (adrenocorticotropic hormone), AVP (Argininvasopressin), and aldosterone were significantly higher in klothokl/klD+ mice than in klotho+/+D+ mice. Additionaly, plasma osmolality, plasma urea, Ca2+, phosphate and Na+, but not K+ concentrations were significantly higher in klothokl/klD+ mice than in klotho+/+D+ mice. In contrast to this, klothokl/klD-/+ mice showed a significantly lower blood pressure than klotho+/+D+ mice. In conclusion, the present observations point to a secondary hyperaldosteronism in Klotho-deficient mice attributable to volume depletion. The differences were partially abrogated by a Vitamin D-deficient diet. Ussing chamber experiments revealed an increased amiloride-sensitive current across the colonic epithelium, indicating an enhanced epithelial sodium channel (ENaC) activity in klothokl/klD+ mice. As a result, the present observations disclose that the excessive formation of calcitriol in Klotho-deficient mice influences not only the mineral but also the electrolyte and fluid balance.