Kausale Zusammenhänge der Expression des Transkriptionsfaktorgens TEC1, des Regulatorgens BCR1 und des Agglutiningens ALS3 in Candida albicans

Abstract

C. albicans ist der häufigste humanpathogene Pilz. Dabei ermöglicht ihm insbesondere seine Fähigkeit zur Ausprägung zweier unterschiedlicher morphologischer Wachstumsformen (Hyphen- und Hefeform) eine spezifische Anpassung an die jeweiligen Umgebungsverhältnisse im Wirt. Zum einen wird durch die Ausbildung von Hyphen eine bessere Adhärenz und auch eine erleichterte Invasion der äußeren Zellbarriere erreicht, zum anderen erfolgt in der Hefeform eine effizientere Dissemination im menschlichen Blutkreislauf. Der Übergang zwischen den verschiedenen Wachstumsformen wird durch ein komplexes Netzwerk verschiedener Signaltransduktionswege reguliert. Eine tragende Rolle kommt hierbei dem Transkriptionsfaktor Tec1p, einem Mitglied der TEA/ATTS-Transkriptionsfaktoren-Familie, zu. Dieser übt einen regulativen Effekt auf zahlreiche hyphenspezifische Gene aus, unter anderem auf BCR1 und ALS3. Dabei ist nach wie vor unklar, durch welche Wechselwirkung auf DNA-Ebene Tec1p diesen Effekt entfaltet. Es sind sowohl eine direkte Bindung über spezifische TCS-Motive als auch indirekte Wirkungen über Induktion anderer Transkriptionsfaktoren denkbar. So geht man zwar davon aus, dass Bcr1p einen direkten Effekt auf die ALS3-Expression hat (Argimón et al, 2007), ob dies aber auch für Tec1p zutrifft, oder dessen Wirkung lediglich über Induktion von BCR1 erfolgt, wird weiterhin kontrovers spekuliert.

Im Rahmen dieser Arbeit wurde durch Expressionsanalysen der drei genannten Gene unter hefe- und hypheninduzierenden Bedingungen sowie in drei Candida-Stämmen mit wildtypischer, fehlender und konstitutiver TEC1-Expression eine nähere Charakterisierung dieser Wirkungskette durchgeführt. Hierzu war zunächst die Etablierung einer geeigneten Messmethodik notwendig. Dabei fiel die Entscheidung auf die quantitative realtime-PCR unter Verwendung von Taqman-Sonden. Es wurden verschiedene interne Kalibratoren zur akkuraten Normalisierung der Expressionsmesswerte ausgetestet und zwei davon als fester Standard etabliert. Reproduzierbarkeit, Reliabilität und Validität der Messergebnisse wurden überprüft und der Einfluß möglicher prozessbedingter Störfaktoren wie Enzymeffizienzen und RNA-Qualität evaluiert.

Die durchgeführten Expressionsanalysen zeigten, dass eine konstitutive TEC1-Expression nur unmittelbar initial innerhalb der ersten 10-30 min zu einer Expressionssteigerung von BCR1- und ALS3-Expression führte, weswegen eine posttranskriptionelle Modifikation des TEC1-Transkripts vermutet wird. Die enge zeitliche Kopplung der erhöhten TEC1- und ALS3-Expressionen in dieser Initialphase lassen primär auf eine direkte Tec1p-Wirkung auf den ALS3-Promotor schließen. Dabei wird auf Grund früherer Proteinanalysen eine Tec1p-Bindung an Sequenzen außerhalb der bisher bekannten TEC1-Consensussequenz vermutet. Eine im weiteren Verlauf folgende Steigerung der ALS3-Transkription, wie sie insbesondere unter Hyphenbedingungen zu beobachten war, wird dagegen auf Grund der typischen zeitversetzten Dynamik von TEC1-, BCR1- und ALS3-Expression eher als Effekt von Bcr1p und damit indirekter Wirkung von Tec1p angesehen.

C. albicans is the most common pathogenic fungus in humans. Especially his ability to exhibit either a yeast or a hyphal form makes it possible to adapt to different growth conditions in the host. On the one hand, hyphal form facilates adherence and invasion of the outer cellular barrier, on the other hand, yeast form is favorable for a fast dissemination in the blood circuit. The transition between these two forms is regulated by a complex network of signal transduction pathways. Tec1p, a member of the TEA/ATTS-transcription factor family, plays a major role by regulating many hyphal-specific genes like BCR1 and ALS3, but molecular mecanisms are still unknown. There might be either a direct binding of Tec1p on specific TCS-motives or an indirect Tec1p-dependant regulation by induction of other transcription factors, like Bcr1p, which is supposed to have a direct effect on ALS3-expression (Argimón et al, 2007).

This dissertation aims at a better characterisation of the TEC1-dependent gene regulation by analysation of gene expression of TEC1, BCR1 and ALS3 in three strains of Candida albicans with different TEC1-expression-patterns (wild type, missing and constitutive TEC1-expression). An appropriate method to quantify expression levels under different growth conditions was developed, using real time PCR and taqman probes. Different internal calibrators for an accurate internal normalization were tested and two of them established as a fix standard. Evaluation of the new method confirmed good reproducability, reliability and validity of the results and ruled out potential process associated influence factors like enzyme efficiency or quality of RNA.

Analysis of TEC1-expression-patterns in a strain with constitutive TEC1-expression showed only an initial enhancement of BCR1- and ALS3-expression within the first 10-30 minutes, most likely due to a posttranscriptional modification of the TEC1-transcript. As there was a high time correlation between TEC1- and ALS3-expression in this initial phase, a direct effect of Tec1p on the ALS3 promoter is quite supposable. Considering former analysis of the protein structure of Tec1p, a direct binding to DNA-sequences other than than the TEC1 consensus sequence is assumed. Post initial increasement of ALS3-expression, as it was especially seen in hyphal forms, seems to be rather an indirect effect of Tec1p, mediated by Bcr1p, as there was a typical time-shift in dynamics of expression of TEC1, BCR1 and ALS3.