Durchflusszytometrische Bestimmung der Minimal Residual Disease bei pädiatrischen Patienten mit akuten Leukämien

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URI: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:21-opus-61919
http://hdl.handle.net/10900/45967
Dokumentart: Dissertation
Date: 2012
Language: German
Faculty: 4 Medizinische Fakultät
Department: Medizin
Advisor: Lang, P. (Prof. Dr.)
Day of Oral Examination: 2010-11-26
DDC Classifikation: 610 - Medicine and health
Keywords: Akute Leukämie , Kinderheilkunde , Durchflusscytometrie
Other Keywords:
Leukemia , Pediatrics , Flow cytometry
License: Publishing license including print on demand
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Inhaltszusammenfassung:

Für Patienten mit akuten Leukämien konnte nachgewiesen werden, dass bei Diagnosestellung rund 10^12 maligne Zellen verteilt im Knochenmark und peripheren Blut vorhanden sein können. Selbst Patienten in vollständiger klinischer Remission können jedoch noch immer bis zu 1010 neoplastische Zellen besitzen, die mit morphologischen Methoden (z.B. Knochenmarkausstrich) allein nicht detektierbar sind. Im Rahmen von Untersuchungen der minimalen Resterkrankung (MRD) werden diese Zellen, welche für die Persistenz einer Leukämie und die Entstehung von Rezidiven verantwortlich gemacht werden, näher charakterisiert und beschrieben. Dabei zeigte sich, dass mit einer größeren MRD-Last ein höheres Risiko eines ungünstigen Krankheitsverlaufs assoziiert ist. Neben der etwas länger etablierten Methode des MRD-Nachweises durch PCR-Techniken wurde in den vergangenen Jahren vermehrt die MRD-Bestimmung mittels Durchflusszytometrie untersucht. Für die beiden konkurrierenden Methoden wurden in mehreren Studien konkordante Ergebnisse nachgewiesen, die PCR scheint jedoch in der Praxis den Vorteil einer höheren Sensitivität zu bieten, wogegen die Durchflusszytometrie eine breitere Verfügbarkeit, die schnellere Durchführung und Aussagen auf dem Niveaue inzelner Zellen erlaubt. Studienziel dieser Arbeit war neben der Optimierung der bereits etablierten MRD-Messung am vorhandenen 4-Farben-Durchflusszytometer die Etablierung der Methode auf das multi-color-Durchflusszytometer von BD Biosciences mit 4 Lasern, um so die bislang durch die maximale Anzahl gleichzeitig messbarer Farben begrenzten Möglichkeiten der Methode zu erweitern. Schließlich sollten exemplarisch vergleichende Messungen an klinischen Patientenproben durchgeführt werden, um die MRD-Bestimmung mit zehn und mehr Farben gegenüber der bisherigen Methode mit vier Farben zu evaluieren. Zur Optimierung der bisherigen Messungen entwickelten wir einen neuen Auswertungsalgorithmus zur genaueren Aufreinigung und somit zur besseren Differenzierung potentieller Blasten von negativen Zellen oder Zelltrümmern. Dazu war es primär notwendig, gesundes bzw. regenerierendes Knochenmark gesunder Kinder systematisch zu analysieren. Beim Transfer der Messungen auf das neue Durchflusszytometer erfolgte zunächst die technische Aufrüstung des Geräts und anschließend die Entwicklung eines aussagekräftigen Vitalitätstests mit reaktiven Farbstoffen, um die Analysen auf vitale Zellen fokussieren zu können. Schließlich galt es, eine sinnvolle und praktikable Kombination bzw. Verteilung der in jedem Messröhrchen benötigten Antikörper auf die zur Verfügung stehenden Kanäle zu finden, was wir durch die Definition eines 10-Farben-Backbones aus CD10/CD38/CD34/CD45/CD56/CD3/CD14/CD19/CD16/AF350 für die B-Linien-ALL erreichten. Nach Einführung neuer Gating-Strategien demonstrierten wir abschließend die Messergebnisse von insgesamt sechs Knochenmarkproben zweier ALL-Patienten jeweils zum Zeitpunkt der Erstdiagnose und zwei Zeitpunkten im weiteren klinischen Verlauf. Die Ergebnisse wurden in Vergleich zu den zuvor am 4-Farben-Durchflusszytometer bestimmten Werten gesetzt und fielen konkordant aus. Diese Arbeit legt den Grundstein für weitere, systematische Analysen von Patientenproben unter Ausnutzung der durch das erweiterte Panel synchron einsetzbarer Marker und der aus der größeren Informationsdichte resultierenden höheren Sensitivität.

Abstract:

For patients with acute leukemia could be shown that at the time of diagnosis, approximately 10^12 malignant cells in the bone marrow and peripheral blood may be present. Even patients in complete clinical remission may still have up to 10^10 neoplastic cells not detectable via morphological methods (e.g. bone marrow examination). As part of investigations of minimal residual disease (MRD), these cells, which are blamed for the persistence of leukemia and the development of relapses are characterized and further described. It was found that a larger burden of MRD is associated with a higher risk of an unfavorable course of disease. Besides the longer-established method of MRD detection by PCR techniques the MRD-determination by flow cytometry was increasingly examined in the recent years. For the two competing methods, several studies have shown concordant results, the PCR appears to have a greater sensitivity to offer in practice, while the wider availability, the faster implementation and statements on the level of single cells appears to be an advantage of flow cytometry. Study objective of this work was, in addition to the optimization of the already established MRD measurement on the existing 4-color flow cytometry, to establish the method on a multi-color flow cytometer from BD Biosciences with 4 lasers, so the previously limited maximum number of measurable colors could be expanded. Finally, a comparison of the two methods using clinical patient samples should be performed to evaluate the MRD determination with ten or more colors compared to the previous method with four colors. To optimize the present measurements, we developed a new algorithm for more accurate evaluation of purification and thereby achieve a better differentiation of blasts negative cells or cell debris. Therefor it was primarily necessary to analyze healthy and regenerating bone marrow samples of healthy children systematically. When transferring the measurements to the new flow cytometer the technical upgrading of the device and development of a meaningful vitality tests with reactive dyes was initially necessary in order to focus the analysis on vital cells. Finally, we had to find a sensible and workable combination and distribution of the required antibodies in each test tube on the available channels, defined by a 10-color backbone of CD10/CD38/CD34/CD45/CD56/CD3/CD14/CD19/CD16/AF350 for B-ALL lines. After the introduction of new gating strategies, we demonstrated conclusively the results of six bone marrow samples from two ALL patients at the time of initial diagnosis and two times in the further clinical course. The results were compared to those previously examined in the 4-color flow cytometry, and appeared to be concordant. This work lays the foundation for further, systematic analyzes of patient samples using the extended synchronal marker panel and the resulting higher sensitivity of a larger information density.

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