GABAABeta3-Knock-Down mittels siRNA-Injektion (RNAi) mit kombinierter Elektroporation im Neokortex junger Ratten

Abstract

GABAA-Rezeptoren sind in Nervenzellen postsynaptisch lokalisiert und besitzen eine Bindungsstelle für den inhibitorischen Neurotransmitter GABA sowie weitere allosterische Bindestellen, unter anderem für Barbiturate und Neurosteroide an der Beta-Untereinheit (UE). Die Bindung von GABA aktiviert den Einstrom von Chloridionen durch die Kanalpore, was zur Entstehung eines inhibitorischen postsynaptischen Potentials (IPSP) führt. Diese Hyperpolarisation der Membran führt zu einer verminderten Erregbarkeit der postsynaptischen Neurone. Strukturell handelt sich bei den GABAA-Rezeptoren um Heteropentamere, die zum größten Teil aus zwei Alpha-, zwei Beta- und einer Gamma-UE aufgebaut sind. Die Beta3-UE der GABAA-Rezeptoren (GABAABeta3) ist hauptsächlich im Hippokampus, im zerebralen Cortex und Cerebellum lokalisiert. In dieser Arbeit wurde die Expression von GABAABeta3-mRNA im Neokortex der Ratte mittels RNA-Interferenz (RNAi) in vivo manipuliert. RNAi ist ein intrinsischer Mechanismus, der durch small-interfering-RNA (siRNA) vermittelt wird. Die aus 21-23 Nukleotiden lange doppelsträngige siRNA ist in der Lage sich an eine komplementäre Sequenz der mRNA zu binden und mit Hilfe des RNA-induced-silincing-complex (RISC) diese dort zu schneiden. Die Schnittprodukte werden intern abgebaut, was zu einem sogenannten Knock-Down in ihrer spezifischen Ziel-mRNA, hier GABAABeta3-mRNA, und somit zu einer Reduktion der Expressionsrate des Zielproteins führt. Hierfür wurde gegen GABAABeta3 gerichtete siRNA in den Neokortex junger Ratten injiziert. Die Aufnahme der siRNA in die Zellen wurde durch lokale Elektroporation erreicht. Nach 24 Stunden wurden sowohl aus der elektroporierten Region wie auch aus dem unbehandelten kontralateralen Gebiet im gleichen Tier Gewebeproben entnommen und verarbeitet. Durch quantitative Real-Time-PCR wurden die GABAABeta3-mRNA-Expressionsraten relativ zum stabil exprimierten Haushaltsgen HPRT bestimmt. Es kann gezeigt werden, dass die GABAABeta3-mRNA-Expressionslspiegel sowohl in den behandelten Hemisphären als auch im Mittel verglichen mit einer NaCl-injizierten Kontrollgruppe nach 24 Stunden signifikant reduziert waren.

GABAABeta3 targeting siRNA was injected nto the neocortex of young rats. The absorption of the siRNA into the cells was caused by electroporation. 24h after injection and electroporation samples were taken of the electroporated area as well as of the non-treated contralateral hemisphere in the same animal. Real-time PCR was used to express the GABAABeta3-mRNA-expression-level relative to the housekeeping gene HPRT. In this work a significant reduction of the GABAABeta3-mRNA-expression-level in the treated hemisphere was shown.