Nachweis von Prevotella intermedia und Antikörperbildung gegen P. intermedia bei Patienten mit Cystischer Fibrose

Abstract

Bei der Cystischen Fibrose, der häufigsten autosomal-rezessiv vererbten Krankheit der kaukasischen Bevölkerung, kommt den pathophysiologischen Vorgängen in der Lunge besondere Bedeutung zu. 80-95% der Patienten versterben aufgrund von Ateminsuffizienz, welche durch pulmonale bakterielle Infektionen bedingt ist. Neben Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Haemophilus influenza, Burkholderia cepacia und Stenotrophomonas maltophila infizieren anaerobe Bakterien wie Prevotella intermedia die Lungen von CF-Patienten. In der vorliegenden Arbeit wurde eine neue Methode zum Nachweis von P. intermedia in Sputum von CF-Patienten etabliert. Zusätzlich wurden Antikörper gegen das Bakterium im Serum der Patienten bestimmt. Es konnte gezeigt werden, dass P. intermedia durch FISH mit der PNA-Sonde „Prevotella Genus PNA“ direkt in Sputumproben von CF-Patienten detektiert werden kann. Der Nachweis durch die PNA-Sonde ist nicht spezifisch, da auch das Bakterium P. nigrescens detektiert wird. Durch „Prevotella Genus PNA“ wurden in 40% der Sputumproben P. intermedia/P. nigrescens nachgewiesen. Nach erfolgreicher Isolation von 4 Stämmen wurde das Ergebnis durch das Anaerobiernachweissystem „Rapid ID 32 A“ bestätigt. Die Differenzierung zwischen P. intermedia und P. nigrescens erfolgte durch MALDI-TOF-MS und DNA-Sequenzierungsanalysen. Dabei wurden 2 Isolate als P. intermedia und die beiden übrigen als P. nigrescens und P. melaninogenica identifiziert. Bei der Resistenzbestimmung gegenüber Ampicillin, Clindamycin, Piperacillin/Tazobactam, Ceftazidim, Meropenem und Metronidazol wiesen die Isolate bis auf eine Ausnahme keine Resistenzen auf. Lediglich ein P. intermedia-Isolat zeigte sich intermediär sensibel gegenüber Ceftazidim. In den Serumproben der CF-Patienten wurden mittels ELISA im Vergleich zur gesunden Kontrollgruppe signifikant erhöhte IgG-Antikörpertiter gegen P. intermedia festgestellt. Dabei waren sowohl die IgG-Serumtiter der CF-Patienten mit als auch ohne pulmonale P. aeruginosa-Besiedlung im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant erhöht. Alle CF-Patienten, in deren Sputumprobe P. intermedia gefunden wurde, wiesen deutlich erhöhte IgG-Titer gegen das Bakterium auf. In der vorliegenden Arbeit konnte erstmalig gezeigt werden, dass P. intermedia durch die PNA-Sonde „Prevotella Genus PNA“ direkt im Sputum von CF-Patienten nachweisbar ist, was für die Diagnostik von entscheidendem Vorteil ist. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass sich das Immunsystem der Patienten in Form einer IgG-Antikörperbildung aktiv mit dem Bakterium auseinandersetzt, was einen wichtigen Aspekt für das Verständnis des Verlaufs der Pathogenese der Lungenerkrankung bei CF darstellt.

Die der Arbeit zugrundeliegenden Daten wurden bereits teilweise veröffentlicht in: Thorax 2010;65(11):978-84.

In cystic fibrosis, which is the most common inherited autosomal-recessive disease, the pathophysiological process in the lungs of patients has particular significance. 80-95% of the patients die of respiratory insufficiency due to pulmonary bacterial infections. Besides Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Haemophilus influenza, Burkholderia cepacia und Stenotrophomonas maltophila anaerobe bacteria such as Prevotella intemedia infect the lungs of patients with cystic fibrosis. In this dissertation a new method for the detection of P. intermedia in sputum samples of patients with cystic fibrosis was established. Additionally antibodies against the bacteria were detected in the patients’ blood serum. We were able to show that P. intermedia can be detected directly in sputum samples of CF-patients by FISH with the PNA-probe “Prevotella Genus PNA”. As also Prevotella nigrescens is detected by the probe it is not specific for P. intermedia. By the use of “Prevotella Genus PNA” detection of P. intermedia/P. nigrescens was possible in 40% of the examined sputum samples. After the successful isolation of 4 strains the result was confirmed by “Rapid ID 32 A”, a detection-system for anaerobe bacteria. The distinction between P. intermedia and P. nigrescens was performed by MALDI-TOF-MS and analysis of DNA-sequences. Thereby 2 isolates were identified P. intermedia, the two others P. nigrescens and P. melaninogenica. In testing of resistance to Ampicillin, Clindamycin, Piperacillin/Tazobactam, Ceftazidim, Meropenem and Metronidazol the isolates with one exception showed no resistances. Only one isolate of P. intermedia was intermediately sensitive to Ceftazidim. In the bloodserum-samples of the CF-patients compared to the control group significantly elevated IgG-antibody-titers against P. intermedia were found by ELISA. The IgG-titers of patients with and without pulmonary P. aeruginosa-colonization were significantly elevated compared to the control group. All CF-patients which had P. intermedia in their sputum sample showed a clear elevation of IgG-titer against P. intermedia. This work for the first time showed that P. intermedia can be detected directly in sputum samples of CF-patients by the PNA-probe „Prevotella Genus PNA“, which is an immense advantage in diagnostics. Additionally it could be shown that the immune system of the patients actively interferes with the bacteria by producing IgG-antibodies which is an important fact to the understanding of the pathogenesis of pulmonary disease in cystic fibrosis.

Die der Arbeit zugrundeliegenden Daten wurden bereits teilweise veröffentlicht in: Thorax 2010;65(11):978-84.