Die einen permanenten neonatalen Diabetes verursachende Mutation Q1178R im Sulfonylharnstoffrezeptor SUR1 und deren Auswirkungen auf die Ligandbindungseigenschaften

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URI: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:21-opus-59326
http://hdl.handle.net/10900/45918
Dokumentart: Dissertation
Date: 2011
Language: German
Faculty: 4 Medizinische Fakultät
Department: Medizin
Advisor: Quast, Ulrich (Prof. Dr.)
Day of Oral Examination: 2011-10-20
DDC Classifikation: 610 - Medicine and health
Keywords: Sulfonylharnstoffrezeptor , Glibenclamid , Insulinsekretion , Benzothiadiazine
Other Keywords: KATP-Kanal , SUR1(Q1178R) , Aminosäureaustauschmutation , Neonataler Diabetes
KATP-channels , Sulfonylurea receptor , Neonatal diabetes
License: Publishing license excluding print on demand
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Inhaltszusammenfassung:

Die ATP-empfindlichen Kaliumkanäle (KATP-Kanäle) sind schwach einwärts gleichrichtende Kaliumkanäle. Sie setzen sich aus zwei Untereinheiten mit einer 4 : 4 Stöchiometrie zusammen: Der porenbildenden Untereinheit Kir6.x und der Steueruntereinheit SURx, einem ABC-Protein. Das Hauptcharakteristikum der KATP-Kanäle ist ihre Steuerung durch Nukleotide: Intrazelluläres ATP führt zum Schließen, das ATP-Abbauprodukt ADP in der Form von MgADP hingegen zur Öffnung der Kanäle. Durch KATP-Kanäle werden der metabolische Zustand der Zelle und die elektrische Aktivität der Zellmembran miteinander verknüpft. Am besten bekannt sind die KATP-Kanäle in den beta-Zellen des Pankreas’, wo sie als indirekter Glukosesensor die Kopplung der Insulinsekretion an den Blutzuckerspiegel gewährleisten. Synthetische Schließer des Kanals (z.B. Glibenclamid, Repaglinid) haben ihren Platz als orale Antidiabetika in der Therapie des Typ 2-Diabetes mellitus. Öffner (z.B. Diazoxid, Cromakalim, Minoxidilsulfat) können je nach Selektivität bei Hyperinsulinämie oder Bluthochdruck eingesetzt werden. Sowohl die Kanalschließer als auch die Öffner binden an den SUR. Mutationen des Kanals führen oft zu Störungen der Insulinsekretion. Die hier untersuchte Mutation Kir6.2/SUR1(Q1178R), bei der im SUR1 an der Stelle 1178 die Aminosäure Glutamin gegen Arginin ausgetauscht ist, führt zu einer Überaktivität des Kanals, die beim Menschen (heterozygot) eine kongenitale Hypoinsulinämie und einen permanenten neonatalen Diabetes herbeiführt. Gegenstand dieser Arbeit war die Charakterisierung der Ligand-Bindungseigenschaften des mutierten Kanals im Vergleich zum Wildtyp. Dazu wurden beide Kanäle transient in HEK 293-Zellen exprimiert und in Membranen aus diesen Zellen wurden Radioligandenbindungsstudien mit Tritium-markiertem Glibenclamid ([3H]GBC) bei 37 °C durchgeführt. In Abwesenheit von MgATP war in Sättigungsversuchen mit [3H]GBC die Affinität von GBC für die Mutante leicht geringer als die für den Wildtyp. Die Bindungskapazität war unverändert, was darauf hindeutet, dass die Mutation die Expression des Kanals nicht beeinträchtigt. Die Hemmung der [3H]GBC-Bindung durch den Öffner NNC 55-0462 (NNC, ein hochaffines Diazoxid-Analog) war leicht verstärkt. Zusammengefasst deuten diese Veränderungen darauf hin, dass die Mutation Konformationsänderungen in der Bindungstasche des SUR herbeiführt. Die Gegenwart von MgATP hemmt die Bindung von GBC und fördert die der Öffner. Die Mutation sensibilisiert den Kanal für die Hemmung durch MgATP (Linksverschiebung der Hemmkurve) und verstärkt die maximale Hemmung. In Sättigungsversuchen bei 1 mM MgATP war die [3H]GBC-Bindung an die Mutante signifikant in Affinität und Bindungskapazität verschlechtert; hingegen war die negativ allosterische Hemmung der [3H]GBC-Bindung durch Benzothiadiazine (Diazoxid und NNC) verstärkt. Im Kontext eines stark vereinfachten Dreistufenschemas der Kanalaktivität, das zwischen Ruhe-, prähydrolytischen und posthydrolytischen Zustand unterscheidet, kann jedem Zustand eine Kanalkonformation mit veränderten Bindungseigenschaften zugeordnet werden. Die Ergebnisse stehen im Einklang mit der von Babenko (2008) aufgestellten Hypothese, dass die Mutation SUR1(Q1178R) zu einer deutlichen Stabilisierung des posthydrolytischen Zustandes des SUR führt; dieser ist mit einer Kanalöffnung assoziiert. Die verstärkte Kanalaktivität führt zu einer Hyperpolarisation der beta-Zellen und damit einer stark verminderten Insulinsekretion auch bei hohen Blutzuckerspiegeln.

Abstract:

ATP-sensitive K+ channels (KATP-channels) are weak inward rectifiers. They are assembled from two subunits, the pore-forming subunit Kir6.x and the regulatory subunit SURx in a 4:4 stoichiometry. SURx, the sulfonylurea receptor, is a member of the ABCprotein family. The hallmark of these channels is their gating by nucleotides: Intracellular ATP causes the channels to close, whereas its hydrolysis product, ADP (as MgADP), induces channel opening. Thereby KATP-channels link cellular metabolism and excitability. So far, the physiological role of these channels is best understood in pancreatic beta-cells, where they act as indirect glucose sensors and couple insulin secretion to the blood glucose level. Synthetic inhibitors of the channel such as glibenclamide (GBC) and repaglinide are widely used in the therapy of type 2 diabetes mellitus. In contrast, K+ channel openers (KCOs) like diazoxide and cromakalim are used for the treatment of hyperinsulinemia or hypertension, depending on their selectivity for KATP-channel subtypes. Both types of drugs bind to SUR. Mutations in the pancreatic KATP-channel often lead to defects in insulin secretion. In this study we examined the mutation Kir6.2/SUR1(Q1178R), in which glutamine 1178 is replaced by arginine. In the human, this mutation (in the homozygous case) causes hypoinsulinemia and permanent neonatal diabetes. It was the aim of this study to examine to which degree the mutation changed the ligand binding properties of the channel as compared to wild-type (WT). To this end, the channels were transiently expressed in HEK 293 cells and radioligand binding studies were conducted in membranes from these cells at 37 °C using [ 3H]GBC as radioligand. In the absence of MgATP, saturation experiments with [3H]-GBC showed a slightly lower affinity of GBC for the mutant channel than for WT. The binding capacity (Bmax), however, remained unchanged, suggesting that the mutation did not affect the expression of the channel. The inhibition of [3H]GBC -binding by the KCO, NNC 55-0462 (a diazoxide analogue), was slightly strengthened by the mutation. These findings suggest that the mutation induces a conformational change of the binding pocket of SUR. MgATP is known to inhibit GBC-binding and to favour KCO-binding. The SUR1(Q1178R)-mutation markedly sensitized the channel for the inhibitory action of MgATP on GBC-binding (left-shift of the inhibition curve) and increased maximum inhibition. In saturation experiments in the presence of MgATP (1 mM), both the affinity and the capacity of the [3H]-GBC binding to the mutant channel were significantly reduced. In contrast, the negative allosteric inhibition of the [3H]GBC-binding by benzothiadiazines (diazoxide and NNC) was strengthened by the mutation. In the framework of a simplified 3-state-cycle of the channel activity which distinguishes a resting, a prehydrolytic and a posthydrolytic state, each state can be assigned to a channel conformation with particular binding properties. Our findings are consistent with the hypothesis of Babenko (2008) that the SUR1(Q1178R) mutation stabilizes the posthydrolytic state, which is associated with an increased open probability of the channel. This, in turn, leads to hyperpolarisation of the beta-cell and to a significantly decreased insulin secretion even in the presence of elevated levels of blood glucose.

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