Einfluss der Expression punktmutierter Varianten des Yersinia Adhäsin A (YadA) auf die Expression der periplasmatischen Chaperon-Protease DegP

Abstract

Das klinische Bild einer manifesten Infektion mit dem humanpathogenen, Gramnegativen Stäbchenbakterium Yersinia enterocolitica ist sehr vielfältig und reicht von einer selbstlimitierenden Gastroenteritis bis hin zu einer schweren Sepsis. Ein Pathogenitätsfaktor dieses Bakteriums ist das äußere Membranprotein YadA, ein trimerer Autotransporter. Das Enzym DegP, welches in der periplasmatischen Stressantwort von E. coli eine doppelte Funktion als Chaperon und Protease wahrnimmt, ist auch an der Antwort auf den durch die Expression mutierter YadA Moleküle verursachten Stress beteiligt. Die Untersuchung des Einflusses dieses von YadA verursachten Stresses aufdie Expression von DegP ist Gegenstand der Dissertation. Hierzu wurden mittels Western-Blot mögliche Unterschiede der Proteinexpression von DegP sowohl vor und nach Expression von YadA als auch von verschiedenen Bakterienstämmen, die unterschiedliche YadA Proteine exprimierten, untersucht. Erkennbare Unterschiede waren nicht feststellbar, die basale Expression von DegP war im Vergleich stets hoch. Zur Untersuchung der DegP mRNA-Produktion Expression wurde die mRNA von DegP als auch von YadA isoliert und in cDNA umgeschrieben. Bei Versuchen, die Produkte mittels konventioneller PCR nachzuweisen, wurde ein sehr schneller Abbau der DegP-mRNA festgestellt, so dass das Isolationsprotokoll optimiert werden musste. Im semiquantitativen Vergleich der Transkriptionsrate mittels RT-PCR konnten keine signifikanten Unterschiede in der Expression von DegP in Abhängigkeit von der Expression punktmutierter Varianten von YadA festgestellt werden. Zusammengafasst konnten wir hier zeigen, dass eine hohe basale Expression der DegP-mRNA mit schnellem Abbau vorliegt, sowie eine hohe basale Expression des DegP-Enzyms, die nicht wesentlich durch eine Akkumulation äußerer Membranproteine wie YadA im Periplasma gesteigert wird.

An infection with the Gram negative rod Yersinia enterocolitica can present itself in a pleomorphic manner, ranging from a self-limiting gastroenteritis to a severe sepsis. One pathogenic factor of this bacteria is the outer membrane proteine YadA, a trimeric autotransporter. The enzyme DegP, which fullfills a double role as a chaperone and a protease in the periplasmatic stress response of E. coli is also involved in the stress response induced by the expression of mutated YadA proteins. This dissertation analyses the influence of of the stress caused by the expression of mutated YadA on the expression of YadA. To this effect, the protein expression of DegP before and after the expression of different YadA variants was analysed with Western Blot. No differences could be found on a protein level, with a high basal expression level of DegP. To analyse the DegP mRNA Expression, the DegP and YadA mRNA was isolated and transcribed into cDNA. As DegP mRNA was found to degrade very quickly, the protocoll for the mRNA isolation had to be optimised. In the semi-quantitative analysis of the mRNA transcription with RT-PCR, no significant differences in the expression of DegP in function of the expression of point mutated variants of YadA could be found. In summary, we showed that that the DegP mRNA has a high basal expression with a rapid degradation, which is not significantly influenced by the accumulation of outer membrane proteins in the periplasma.