Analytik von Galaktocerebrosid-3-sulfat im Urin zur Diagnostik der Metachromatischen Leukodystrophie

Abstract

Ziel dieser Arbeit war es das Sphingolipid Galaktocerebrosid-3-sulfat mit Hilfe der Isotachophorese quantitativ im Urin zu bestimmen. Dieses sogenannte Sulfatid wird beim Gesunden durch das körpereigene Enzym Arylsulfatase A abgebaut. Die Arylsulfatase A ist bei Patienten mit Metachromatischer Leukodystrophie (MLD) defekt, sodass das Galaktocerebrosid-3-sulfat in Zellen angehäuft wird und auch im Urin in ca. 30-40fach höherer Konzentration als beim Gesunden vorkommt. Der qualitative Nachweis von Sulfatid im Urin mittels Dünnschichtchromatographie stellt eine Standardmethode zur Diagnostik der MLD dar. Der Vorteil einer quantitativen Bestimmung des Sulfatids mit der Isotachophorese wäre, dass es eventuell möglich würde die Effekte einer Enzymersatztherapie der MLD zu überprüfen. Des weiteren könnte die Diagnostik der MLD vereinfacht und der Materialbedarf gegenüber der Dünnschichtchromatographie verringert werden. Mit Hilfe der Isotachophorese wurde das aus Galaktocerebrosid-3-sulfat abgespaltete Sulfat quantitativ bestimmt. Dazu musste zunächst das im Urin enthaltene freie Sulfat entfernt werden und anschließend das Sulfatid vollständig in Galaktocerebrosid und Sulfat gespaltet werden, damit man von der Konzentration des Sulfats in der Probe auf die des ursprünglich im Urin vorhandenen Sulfatid schließen konnte. Die Sulfatabspaltung erfolgte mit einer rekombinant hergestellten Arylsulfatase A, die auch im Rahmen der Enzymersatztherapie der MLD eingesetzt wird. Durch eine geeignete Aufarbeitung war es möglich, das endogene Sulfat im Urin nachweislich zu entfernen und durch einen geeigneten Puffer konnte eine vollständige Abspaltung des Sulfats von Galaktocerebrosid-3-sulfat durch die rekombinante Arylsulfatase A erreicht werden. Damit konnte das Ziel der Arbeit, das Sulfatid quantitativ im Urin nachzuweisen erreicht werden. Allerdings erwies sich die Konzentration des Galaktocerebrosid-3-sulfats im Urin als zu gering, um eine genaue Bestimmung der Sulfatkonzentration bei einem Probenvolumen von 5 ml Urin zu ermöglichen. Eine Unterscheidung zwischen pathologischem Urin und der Urinprobe eines Gesunden ließ sich aber eindeutig darstellen. Ein größeres Urinvolumen einzusetzen würde dieses Problem möglicherweise beheben, war aber nicht zielführend, da damit die Forderung nach einem geringeren Materialeinsatz gegenüber der Dünnschichtchromatographie nicht mehr gegeben wäre und sich die Massenspektrometrie zunehmend zu einer Standardmethode entwickelt, mit der auch eine Bestimmung des Galaktocerebrosid-3-sulfats durchgeführt werden kann.

The purpose of this analysis was to determine the quantity of the sphingolipid galactocerebroside-3-sulfate in urine by using isotachophoresis. In human cells this so-called sulfatide is degraded by the endogenous enzyme arylsulfatase A. This arylsulfatase A is defective in patients who suffer from metachromatic leukodystrophy (MLD) which causes an accumulation of galactocerebroside-3-sulfate in the cells and leads to a concentration of galactocerebroside-3-sulfate in urine which is 30 to 40 times higher than in a healthy person’s urine. The qualitative analysis of sulfatide in urine by utilizing thin layer chromatography is a standard method for MLD diagnosis. As an advantage of a quantitative analysis of sulfatide by isotachophoresis, it might be possible to monitor the effects of an enzymatic replacement therapy of MLD. Furthermore the diagnosis of MLD could be simplified and material requirements could be reduced in contrast to thin layer chromatography. The fraction of sulfate which was split off the galactocerebroside-3-sulfate was determined quantitatively using isotachophoresis. For that purpose, the free sulfate contained in urine had to be removed first. The next step was to completely split up the sulfatide into galactocerebroside and sulfate. Finally, by measuring the concentration of sulfate in the sample, it was possible to determine the original quantity of sulfatide in the urine. The sulfatide was cleaved using a recombinant compounded arylsulfatase A, which is used also in enzymatic replacement therapy of MLD. By using an appropriate reprocessing technique, it was possible to verifiable remove the endogenous sulfate entirely. With a suitable buffer a complete cleavage of sulfate from the galactocerebroside-3-sulfate by arylsulfatase A could be achieved. In conclusion the purpose of this analysis, which was to quantitatively determine the sulfatide in urine, has been accomplished. However the concentration of galactocerebroside-3-sulfate in urine was too low to perform an exact determination of the concentration of sulfate in a 5 ml sample. It was nevertheless possible to clearly distinguish between pathological and non-pathological urine samples. Using a larger sample might have solved this problem, but this would have gone beyond the scope of this analysis as one of the requirements was to use less material than in thin layer chromatography. Additionally, mass spectrometry which also allows a quantitative determination of galactocerebroside-3-sulfate has recently been developing into a standard method.