Kardiomyogene Differenzierung humaner mesenchymaler Stammzellen

Abstract

Die Differenzierungsfähigkeit, sowie die immunologischen und parakrinen Eigenschaften adulter humaner mesenchymaler Stammzellen (MSCs) bieten aufgrund der verhältnismäßig leichten Verfügbarkeit, sowie der ethischen Unbedenklichkeit dieses Zelltyps großes Potential für die Regenerative Medizin. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, systematisch, anhand unterschiedlicher Protokolle, das kardiomyogene Differenzierungspotential aus Knochenmark gewonnener humaner MSCs zu evaluieren. Darüber hinaus sollten Informationen über die Bedeutung von durch MSCs exprimierte und mit Multipotenz-assoziierte Transkriptionsfaktoren für den Differenzierungsstatus dieser Zellen gewonnen werden. Methodisch wurden zum Nachweis der Regulation relevanter Zielgene quantitative RT PCR-Assays etabliert. Im Sinne einer guten Vergleichbarkeit der Experimente erfolgte eine Grundcharakterisierung der verwendeten Zellpopulationen nach den durch die International Society of Cellular Therapy (ISCT) empfohlenen Kriterien. Demzufolge zeigten alle verwendeten MSC-Populationen eine gute Differenzierbarkeit in adipogener, osteogener und chondrogener Richtung. Für die untersuchten kardialen Markergene konnte eine konstitutive Expression durch unbehandelte MSCs nachgewiesen werden, welche im Lauf der durchgeführten Langzeitkultur einer signifikanten Regulation unterlag. Unter den kardiomyogenen Differenzierungsprotokollen erwiesen sich vor allem das auf einer Kombination der Wachstumsfaktoren PDGF+FGF2+VEGF basierende Medium, sowie das Protokoll Insulin-Transferrin-Ascorbat-Dexamethason (ITAD) als vielversprechend. Von den untersuchten Multipotenz-assoziierten Transkriptionsfaktoren Oct 4, Nanog, Sox2 und DPPA4 konnte für die beiden Erstgenannten eine Expression durch die untersuchten MSC-Populationen nachgewiesen werden. Im Verlauf der Langzeitkultur erfolgte eine signifikante Hochregulation dieser Marker in hohen Kulturpassagen. Unter adipogener Differenzierung zeigten die für Oct-4 und Nanog kodierenden Gene eine signifikant reduzierte Expression, unter osteogener und kardiomyogener Differenzierung blieb diese weitestgehend unbeeinflusst. Die in der vorliegenden Arbeit gewonnenen Daten können für zukünftige zelltherapeutische Ansätze insbesondere im Bereich der kardialen Regeneration von großer Bedeutung sein. Darüber hinaus ist die Expression von Multipotenz-assoziierten Transkriptionsfaktoren durch MSCs von grundlagenwissenschaftlichem Interesse. Zukünftige Experimente werden ein besseres Verständnis der physiologischen Regulation der Multipotenz von MSCs, sowie des Beitrags einzelner MSC-Subpopulationen zu den Eigenschaften dieses heterogenen Zelltyps zum Ziel haben.

Due to their differentiation capacity, as well as their immunomodulatory and paracrine activity, human mesenchymal stem cells (MSCs) exhibit great potential in regenerative medicine. The objective of the present work is to evaluate the efficiency of distinct cardiomyogenic differentiation protocols on bone marrow derived human MSCs. Moreover, the expression of multipotency-associated transcription factors in context of the cellular differentiation state was analyzed. Technically, for assessment of the corresponding cardiomyogenic and multipotency associated target gene expression, quantitative RT-PCR assays were established. To obtain reproducible results, the analyzed cell populations were selected according to the definition criteria released by the International Society of Cellular Therapy (ISCT). All analyzed MSC populations showed high adipogenic, osteogenic and chondrogenic differentiation capacity. Cardiomyogenic marker genes were expressed constitutively by undifferentiated MSCs and were regulated during long term in vitro culture. For induction of cardiomyogenic differentiation of MSCs, protocols based upon the growth factors PDGF+FGF2+VEGF or Insulin+Transferrin+Ascorbat+Dexamethasone (ITAD) respectively, proved to be most effective. The multipotency-associated transcription factors Oct-4 and Nanog were shown to be expressed by undifferentiated MSCs and significantly up regulated during long term in vitro culture. A significant down regulation of these factors occurred under adipogenic, but not osteogenic or cardiomyogenic differentiation. The results published in the present work may be helpful in optimization of cellular therapy for cardiac regeneration. Moreover, the expression and regulation of multipotency-associated transcription factors by MSCs is of high interest for understanding the properties of this cell type.