Identifizierung von Alpha-Tubulin als neues Targetantigen von Antikörpern bei Patienten mit neuropsychiatrischer Manifestation einer Kollagenerkrankung

Abstract

Der Nachweis von Anti-ZNS-Antikörpern in Seren und Liquores von Patienten mit Kollagenosen korreliert eng mit dem Auftreten von neuropsychiatrischen Symptomen. In der vorliegenden Arbeit wurde ein Anti-ZNS-Antikörper, der im Zusammmenhang mit neuropsychiatrischen Symptomen bei Patienten mit Kollagenosen steht, näher charakterisiert. Dieser Anti-ZNS-Antikörper wurde mittels Westernblot und Elisa unter Verwendung eines 100 000 g Überstands aus Rinderhirn als Antigen detektiert. Im Westernblot ausgewählter Patientenseren zeigten 25 von 29 (86.2 %) Antikörper, die mit der 31 kD Determinante des 100 000 g Überstands des Rinderhirns reagierten. Diese Reaktion liess sich auch bei Patienten mit klinisch gesicherter neuropsychiatrischer Manifestation einer Kollagenose bestätigen. 5 von 17 Patienten (29.4 %) mit gesicherter neuropsychiatrischen Manifestation einer Kollagenose wiesen Antikörper gegen die Determinante bei 31 kD Bande auf. Die anschließende Sequenzierung dieser 31 kD Antigendeterminante ergab, dass sie unter anderem das Protein Alpha-Tubulin als korrespondierendes Antigen für die Patienten-Antikörper enthielt. Alpha-Tubulin wurde daraufhin über einen mehrstufigen Prozess in Escherichia Coli Bakterien rekombinant hergestellt, anschließend aufgereinigt und für weitere Untersuchungen als Antigen verwendet. Dabei konnte eindeutig nachgewiesen werden, dass die Antikörper der Patientenseren mit dem rekombinant hergestellten Alpha Tubulin im Westernblot reagierten.

Auch im Elisa konnten die Ergebnisse mit dem 100 000 g Überstand aus Rinderhirn, der daraus eluierten 31 kD-Determinante und dem aufgereinigten Alpha-Tubulin reproduziert werden. 14 von 20 Seren (70 %), die mit dem gesamten 100 000 g Überstand positiv reagiert haben, zeigten eine positive Reaktion mit der eluierten 31 kD Determinante des 100 000 g Überstands, wovon 4 Seren (20 %) auch eine positive Reaktion gegen das aufgereinigte Tubulin zeigten. Diese Untersuchungen belegen, dass bei einer Subgruppe von Patienten mit neuropsychiatrischer Manifestation einer Kollagenose Antikörper gegen Alpha-Tubulin vorkommen, die damit zumindest einen diagnostischen Stellenwert erhalten. In wie weit sie auch in die Pathogenese involviert sein könnten, muss in weiteren Studien überprüft werden.

In a previous study we found in 50% of patients with neuropsychiatric manifestations of systemic lupus erythematosus (NP-SLE) organ specific antibodies to 45-56 kD proteins in a 100,000 g supernatant (SN) from bovine brain mitochondria. Aim of the present study was to identify the corresponding target antigen. A 100,000 g SN from bovine brain mitochondria was applied to SDS-gel electrophoresis. A 50 kD band recognized by sera from patients with NP-SLE in the Western blot (WB) was excised from the gels and applied to mass spectrometry. The identified protein was expressed in Escherichia coli and retested against sera from eleven patients with NP-SLE (severe symptoms n=6, mild symptoms n=5), 26 SLE-patients without NP manifestations and 53 controls (patients with multiple sclerosis, epilepsy, healthy blood donors). Mass spectrometry of the 50 kD band revealed the presence of alpha-tubulin. Applying the recombinant alpha-tubulin in the WB, four of the eleven NP-SLE patients (36%), one of the 26 patients with SLE without NP manifestations (4%) and none of the 53 controls reacted with alpha-tubulin. The antibodies were more frequently found in patients with severe (50%) than with mild NP-SLE (20%). alpha-tubulin may be a novel marker autoantigen for a neuropsychiatric manifestation at least in a subgroup of patients with SLE. Whether anti-alpha-tubulin antibodies are of pathogenetic relevance has still to be clarified.