Effekte von Endothelin-1 auf die Phosphorylierung des Insulin-Rezeptor-Substrates-1 an Serin 307 und Serin 318

Abstract

Frühere Arbeiten belegen einen starken Zusammenhang zwischen gestörter Glukosetoleranz und einem erhöhten kardiovaskulären Risiko. Neben einer Reihe anderer Faktoren stellt Endothelin-1 ein mögliches Bindeglied dieser beiden Entitäten dar. Eine chronische Aktivierung des Endothelin-1-Systems kann zu einer gestörten Glukosetoleranz und zur Insulinresistenz führen. Die Endothelin-1-Plasmaspiegel sind bei Adipositas und bei arterieller Hypertonie erhöht und Endothelin-1 führt, wie im Zell- und Tiermodell gezeigt werden konnte, zu einer Beeinträchtigung der Insulinsignalkaskade, die unter anderem eine Serinphosphorylierung an IRS-1 mit einschließt. Die genauen Serinstellen im Detail wurden bislang allerdings nicht identifiziert. Daher galt es in der vorliegenden Arbeit zu untersuchen, ob Serin 307 und Serin 318 Endothelin-1-abhängig phosphoryliert werden. Sowohl Serin 307 als auch Serin 318 sind an der Negativregulation der Insulinsignalkaskade beteiligt. Da dem Skelettmuskel große Bedeutung in der Entstehung der peripheren Insulinresistenz zukommt, wurden C2C12-Myotuben als Zellmodell gewählt. In C2C12-Zellen führte die Stimulation mit Endothelin-1 für 30 Minuten zu einer starken Phosphorylierung von IRS-1 sowohl an Serin 307 als auch an Serin 318, bereits schon bei einer Konzentration von 0,1 µM, die durch eine Steigerung der Konzentration nicht weiter erhöht werden konnte. Die daraufhin mit 0,1 µM Endothelin-1 durchgeführten Zeitreihen von 0-180 Minuten zeigten für Serin 307 nach 15 Minuten einen deutlichen Anstieg der Phosphorylierung und ein Maximum bei 30 Minuten. Bei Serin 318 war bereits nach 1 Minute ein deutlicher Anstieg der Phosphorylierung zu erkennen, der ebenfalls ein Maximum bei 30 Minuten zeigte. Nach 60 Minuten der Endothelin-1-Stimulation war eine Abschwächung der Phosphorylierung zu beobachten, die nach längerer Inkubation noch weiter abnahm. Die Vorinkubation mit Inhibitoren der PI3-Kinase LY294002 (10 µM) und von mTOR Rapamycin (25 nM) führten zu einer signifikanten Reduktion der Insulin-induzierten IRS-1-Phosphorylierung an Serin 318. In Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen führte die Stimulation mit Endothelin-1 zu einer verstärkten Phosphorylierung der PI3-Kinase- und mTOR-Substrate Akt und p70S6-Kinase. Unsere Ergebnisse bestätigen somit, dass die PI3-Kinase und mTOR im Zellsystem mit C2C12-Myotuben durch Stimulation mit Endothelin-1 aktiviert werden und legen eine wichtige Rolle des PI3-Kinase/mTOR-Signalweges in der Endothelin-1-induzierten Serin-307- und Serin-318-Phosphorylierung nahe. Durch Vorbehandlung mit Endothelin-1 wurde die durch Insulin induzierte Glukoseaufnahme in L6-Myotuben signifikant reduziert. Abschließend konnte gezeigt werden, dass Endothelin-1 auch zu einer Phosphorylierung an Serin 318 in Adipozyten, einem weiteren für die Entstehung der peripheren Insulinresistenz wichtigen Gewebe, führte. Die Untersuchung der an der Endothelin-1-vermittelten Serin-307-Phosphorylierung von IRS-1 beteiligten Kinasen sowie die weitere Aufklärung der Interaktion der einzelnen Serinphosphorylierungen und deren Einfluss auf die Insulinsignalkaskade bleibt weiteren Experimenten vorbehalten. Ziel solcher Versuche sollte dabei immer die Aufdeckung möglicher pharmakologischer Angriffspunkte zur Verbesserung der Insulinsensitivität sein.

In earlier publications a strong correlation between a deranged glucose tolerance and an elevated risk of cardiovascular diseases was demonstrated. Beside a lot of other factors, Endothelin-1 is a possible link. Chronic activation of the Endothelin-1 system could induce glucose tolerance and insulin resistance. Plasma levels of Endothelin-1 are elevated in obese persons and those with arterial hypertension. So Endothelin-1 affects the signaling of insulin as experiments with cells and animals have shown. This effect includes the serin phosphorylation of IRS-1. The serin positions in detail are not yet identified and so the aim of this dissertation was to investigate whether Endothelin-1 leads to a phosphorylation of Serin 307 or Serin 318 in IRS-1. Both Serin sites are involved in the down regulation of the insulin signalling cascade. As the sceletal muscle is important in the development of the peripheral insulin resistance, we chose C2C12 myotubes as our cells for the experiments. In C2C12 myotubes the stimulation with Endothelin-1 for 30 minutes induces a strong phosphorylation of Serin 307 and Serin 318 in IRS-1 even in a concentration of 0,1 µM which could not be elevated with higher concentrations. The peak of the stimulation time was about 30 minutes. The preincubation with the inhibitors of the PI3-kinase LY294002 (10 µM) and the inhibitors of mTOR Rapamycin (25 nM) induced a significant reduction of the Insulin- induced Serin 318 phosphorylation of IRS-1. In accordance with these results a stimulation with Endothelin-1 induced a stronger phosphorylation of the PI3-kinase and of mTOR substrates Akt and p70S6 kinase. The results confirm that PI3-kinase and mTOR get activated in C2C12 myotubes by a stimulation with Endothelin-1 and suggest an important function of the PI3-kinase/mTOR signalling pathway in the Endothelin-1 induced phosphorylation of Serin 307 and Serin 318. By preincubation with Endothelin-1 a significant reduction of the glucose reuptake in L6 myotubes can be achieved,too. In conclusion it could be demonstrated that Endothelin-1 also elevates the phosphorylation of Serin 318 in adipocytes as another important tissue for the development of insulin resistance. In future experiments the involved kinases of the Endothelin-1 induced phosphorylation of Serin 307 in IRS-1 should be investigated as well as the interaction of the serin phosphorylation sites by themselves and their influence on the insulin signaling cascade. The aim of such investigations should always be to detect possible contact points for pharmacological treatment to improve insulin sensitivity.