Die Auswirkung von Hypoxie auf die intestinale Tight Junction: Rolle des Transkriptionsfaktors Hypoxia Inducible Factor 1 (HIF-1)

Abstract

EINFÜHRUNG: Entzündliche Reaktionen des Darmtraktes führen, durch gestörte Perfusion und gesteigerten metabolischen Umsatz, zur Entstehung einer intestinalen Sauerstoffschuld. Dies führt zu einer Schwächung der epithelialen Barriere, was den Übertritt luminaler Xenobiotika begünstigt. Daraus kann die unkontrollierte Stimulation des intestinalen Immunsystems durch systemische Effekte luminaler proinflammatorischer Moleküle wie Lipopolysaccharid (LPS) resultieren, was in der Entstehung eines systemischen inflammatorischen Response-Syndroms (SIRS) sowie Multiorganversagen (MOF) münden kann. Studien unserer Arbeitsgruppe charakterisierten Hypoxie dabei als kritischen pathogenetischen Faktor des Barriereversagens. Ziel der vorliegenden Arbeit war es deshalb, die noch zu großen Teilen unverstandenen Mechanismen hypoxischer Barriereschwächung mit einem molekularen Korrelat in Verbindung zu bringen und die zugrunde liegenden regulatorischen Mechanismen zu identifizieren. Dabei konzentrierten wir uns auf die Tight Junction (TJ), welche hauptsächlich die Durchlässigkeit des epithelialen Zellverbandes reguliert. Im Zusammenhang damit betrachteten wir genauer die hypoxische Regulation der Proteine Zonula occludens 1 bis 3 (ZO-1 bis -3), welche als Verbindungsproteine zwischen Barrierekontakt und Zytoskelett eine wichtige organisierende Einheit der TJ darstellen.

ERGEBNISSE & METHODEN: Hypoxie bewirkte einen Anstieg der parazellulären Permeabilität sowie eine gesteigerte Translokation bakterieller Bestandteile in vivo, was wir anhand von Permeabilitäts-Assays (FITC-Dextran resp. Limulus Amebocyte Lysate) in einem murinen Ganzkörper-Hypoxiemodell zeigen konnten. Im Zusammenhang damit stellten wir erstmals mittels Gefrierbruch-Elektronenmikroskopie die dramatische Desorganisation der tight-junktionalen Architektur unter Hypoxie in vitro dar. Diese Beobachtung korrelierte mit einer Herunterregulation der Proteine ZO-1 bis -3 in vitro und in vivo sowohl auf transkriptioneller (Real-time PCR) als auch translationaler (Western Blot) Ebene. Dabei lieferte die Auswertung der Literatur insbesondere für ZO-1 eindeutige Hinweise auf dessen permeabilitätsbeeinflussenden Effekt. Daran anknüpfend belegte die immunhistochemische Färbung gegen ZO-1 dessen gezielte Entfernung von der TJ unter Hypoxie. Die anschließende softwaregestützte Promoteranalyse (Gene2Promoter, MatInspector; Genomatix-Software) zeigte eine Reihe möglicher Bindungsstellen für O2-sensible Transkriptionsfaktoren – vor allem auch für HIF-1. Eine Herunterregulation von ZO-1 in HIF-1-überexprimierenden Zellen (lentiviraler Gentransfer; Messung mittels Luciferase-Assay) bot deutliche Hinweise auf die regulative Beteiligung des Transkriptionsfaktors. Die darauf folgende Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP-Assay) bewies die Bindung von HIF-1 an den ZO-1 Promoter. Eine anschliessende Punktmutation der vermuteten Bindungssequenz ergab, dass der Transkriptionsfaktor nicht mit der zuvor ermittelten HIF-1 Bindungsstelle interagiert, sondern sehr wahrscheinlich mit einer Aryl-hydrocarbon receptor repressor Sequenz (AHRR), welche sich ebenfalls im untersuchten Promotersegment befand.

FAZIT: Unsere Ergebnisse zeigen, dass Hypoxie eine Steigerung der intestinalen parazellulären Permeabilität bewirkt. Dieser Beobachtung liegen Veränderungen der tight-junktionalen Architektur zugrunde. Hierbei nimmt die hypoxische Herunterregulation von ZO-1 eine wichtige Rolle ein, welche sehr wahrscheinlich durch HIF-1 vermittelt wird. Zusammenfassend betrachtet tragen diese Ergebnisse zu einem besseren Verständnis pathophysiologischer Vorgänge an der TJ bei. Dies ist für die Entwicklung therapeutischer Strategien essentiell, welche ein Barriereversagen mit unkontrolliertem Antigenübertritt bei kritisch Kranken verhindern sollen.

INTRODUCTION: Inflammatory reactions of the gastrointestinal tract cause intestinal hypoxia, due to an increased metabolic rate and decreased perfusion. This leads to impairment of the epithelial barrier, promoting translocation of luminal xenobiotics. The consequence can be an uncontrolled stimulation of the underlying intestinal immune system by systemic effects of luminal proinflammatory agents, such as lipopolysaccharide (LPS). This is able to result in a systemic inflammatory response syndrome (SIRS) or multi organ failure (MOF). In that context, research of our work group identified hypoxia as a critical pathogenetic factor of barrier breakdown. Hence, the objective of this study was to link the still insufficiently understood mechanisms of hypoxic barrier impairment to a molecular substrate and indentify the underlying regulatory mechanisms. For that purpose we focused on the Tight Junction (TJ), which mainly restricts paracellular permeability. In this respect we examined the hypoxic regulation of the proteins Zonula occludens 1 to 3 (ZO-1 to -3), as critical organizing components of the TJ.

MATERIAL & METHODS: Hypoxia causes an increase in paracellular permeability, as well as intensified translocation of bacterial components in vivo. This was shown in a set of permeability assays (FITC-Dextran, Limulus Amebocyte Lysate resp.), performed in a murine whole-body hypoxia model. In that context we demonstrated for the first time a dramatic disorganization of the tight-junctional architecture in vitro by freeze-fracture electron microscopy. This observation correlated with a downregulation of the proteins ZO-1 to -3 in vitro and in vivo, both on transcriptional (Real-time PCR) and translational levels (Western Blot). Analysis of already published literature displayed strong evidence of ZO-1 having influence on paracellular permeability. Following immunohistochemical staining showed the removal of the latter from the TJ under hypoxia. Subsequent computer-based ZO-1 promoter analysis (Gene2Promoter, MatInspector; Genomatix-Software) revealed several binding sites for hypoxia sensitive transcription factors – especially for HIF-1. Downregulation of ZO-1 in cells constitutively overexpressing HIF-1 strongly suggested a regulatory effect of the transcription factor (lentiviral gene transfer; measurement with Luciferase-Assay). Chromatin immunoprecipitation (ChIP-Assay) proved the binding of HIF-1 to the ZO-1 promoter. A subsequently performed point mutation of the suspected binding site showed that the transcription factor does not interact with the targeted sequence, but most likely with an aryl-hydrocarbon receptor repressor sequence (AHRR) which is also located in the examined promoter segment.

CONCLUSION: Our results show an increase of intestinal paracellular permeability under hypoxia. This observation is paralleled by alterations of the tight-junctional architecture. In relation to that, the hypoxic downregulation of ZO-1 plays an important role which is most likely regulated by HIF-1. These results contribute to a better understanding of tight-junctional pathophysiology. This is crucial for the development of therapeutic strategies, in order to prevent barrier breakdown with uncontrolled antigen translocation in the critically ill.