Die Regulation des Kaliumkanals Kv1.5 durch die Serum- und Glukokortikoid-induzierbare Kinase

Abstract

Der Kaliumkanal KV1.5 gehört zur Familie der spannungsabhängigen Kaliumkanäle (KV). Der Kanal verfügt über ein N-terminales und ein C-terminales PDZ-Bindemotiv, das durch Proteine erkannt werden könnte, die ihrerseits über eine PDZ-Domäne verfügen, wie die Gerüstproteine NHERF1 und NHERF2. Die Serum- und Glukokortikoid-induzierbare Kinase (SGK1) spielt bei der verminderten Insulinsekretion bei Dexamethasongabe durch die Regulation von spannungsabhängigen Kaliumkanälen eine Rolle. Die SGK1 nimmt direkten Einfluss auf den KV1.5, jedoch war der genaue Mechanismus bisher unbekannt. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Frage, ob und wie die NHERF Isoformen auf KV1.5 wirken und wie der Signaltransduktionsprozess der SGK1 auf den KV1.5 vonstatten geht. Elektrophysiologische Untersuchungen am Xenopus laevis Modell zeigten, dass sowohl NHERF1 als auch NHERF2 den KV1.5 stimulieren können und dass dazu ein intaktes C-terminales PDZ-Bindemotiv des KV1.5 von Nöten ist. NHERF2 erhöht die Expression des Kanals in der Plasmamembran durch verminderte Internalisierung, wie dies durch Experimente mit Brefeldin A gezeigt werden konnte. Die Stimulation durch die SGK1, die bekannterweise mit ihrer zweiten PDZ-Domäne mit NHERF2 interagiert, wird durch die zusätzliche Expression des NHERF2 noch weiter gesteigert. Diese weitere Steigerung zeigte sich nicht mehr, wenn die zweite PDZ-Domäne des NHERF2 gestört wird. Die Effekte der NHERF-Proteine sind spezifisch für KV1.5, da Experimente mit dem nahen Verwandten KV1.3 keine Stimulation erbringen. Experimente zum Signaltransduktionsprozess der SGK1 zeigen, dass die SGK1 mit der Ubiquitinligase Nedd4-2 interferiert und so die Ubiquitinierung des Kanals hemmt. Bei Koexpression des Kanals mit der Ubiquitinligase Nedd4-2 zeigen sich stark verringerte Ströme in der Voltage-Clamp-Messung. Die SGK1 ist in der Lage zumindest teilweise diese Hemmung zu kompensieren. Es zeigt sich eine durch die SGK1 hervorgerufene Steigerung der Expression des KV1.5 in der Plasmamembran durch verringerte Degradation des Kanals. Zum Schluss lässt sich sagen, dass die NHERF-Proteine an der Regulation der elektrischen Erregbarkeit von Zellen mitwirken, indem sie die Membranexpression des KV1.5 kontrollieren und Moleküle, die am Signaltransduktionsprozess teilnehmen in die Nähe des Kanals bringen. Die SGK1 stimuliert den KV1.5 durch eine Inhibition der Ubiquitinierung durch die Nedd4-2, was zu einer Stabilisierung in der Plasmamembran führt. Die Kinase könnte dadurch teilweise an der Regulation der Insulinsekretion durch Kontrolle des KV1.5 eine Rolle spielen.

Kv1.5 belongs to the family of voltage-gated potassium (Kv) channels and contains a N- and a C-terminal PDZ-binding motif that might be recognized by PDZ domains on the scaffold proteins NHERF1 and NHERF2. The serum and glucocorticoid inducible kinase SGK1 is involved in dexamethasone-induced inhibition of insulin secretion by increasing voltage-gated potassium channel (Kv) activity. SGK1 upregulates the Kv1.5 channel but the precise mechanism underlying the SGK1 dependent regulation of Kv1.5 has not been defined yet. The thesis explored the signal transduction processes involved. Experiments with Xenopus oocytes revealed that SGK1 promotes channel activity by interfering with the Nedd4-2 ubiquitination pathway, irrespective of the presence of putative SGK1 phosphorylation sites on Kv1.5. Expression of the ubiquitin ligase Nedd4-2 declined Kv1.5 currents by ubiquitinating and thereby reducing Kv1.5 plasma membrane expression. Increasing concentrations of SGK1 gradually compensated the inhibiting effect of Nedd4-2 on Kv1.5. Enhanced Kv1.5 surface abundance by SGK1 reflects decreased channel internalization as indicated by Brefeldin A experiments. In conclusion, Kv1.5 upregulation by SGK1 involves inhibition of channel ubiquitination by Nedd4-2 that leads to Kv1.5 stabilization in the plasma membrane. Our results suggest that the kinase might participate in the regulation of insulin secretion in part by controlling Kv1.5 surface abundance. Further experiments with Xenopus oocytes demonstrated that NHERF1 and NHERF2 activate Kv1.5, an effect requiring the C-terminal PDZ-binding motif on Kv1.5. NHERF2 enhances Kv1.5 activity and cell surface expression as determined by electrophysiology and immunoassays. NHERF2 elevates Kv1.5 abundance at the plasma membrane by decreasing channel internalization as proven by Brefeldin A experiments. Kv1.5 is stimulated by the serum and glucocorticoid inducible kinase SGK1, a kinase known to interact with the second PDZ domain of NHERF2. This study aims to identify if SGK1 and NHERF2 synergize to increase Kv1.5 currents. Expression of NHERF2 potentiated SGK1-mediated Kv1.5 activation, which was significantly attenuated by deletion of the second PDZ domain in NHERF2. Specificity of observed effects was verified by evaluating the influence of NHERFs on Kv1.3, a known SGK1 target that contains an internal PDZ binding motif.