T-Zell-Antwort bei Nierenkrebspatienten nach Peptid-basierter Immuntherapie

Abstract

In dieser Arbeit wurden die T-Zellen von Patienten untersucht, welche im Rahmen einer Immuntherapie-Studie zur adjuvanten Behandlung des fortgeschrittenen Nierenzellkarzinoms Peptidvakzinierungen erhalten hatten. Bei der Studie handelt es sich um eine Kooperation der Klinik für Urologie der Universität Tübingen mit dem Interfakultären Institut für Zellbiologie, Abteilung Immunologie Tübingen. Die Patienten wurden entsprechend ihres HLA-Typs in HLA-A*02-positiv und -negativ unterteilt und dann randomisiert zwei Studienarmen zugeordnet. Die eine Gruppe erhielt GM-CSF als Adjuvans zu den intradermal injizierten Peptiden, während die andere Gruppe die Peptide subkutan in einer Emulsion mit Montanide verabreicht bekam. In beiden Studienarmen waren bis zu 18 Vakzinierungen über ein Jahr vorgesehen, die unterbrochen wurden, wenn die Erkrankung progredient war. Zum Zeitpunkt der in der vorliegenden Arbeit gezeigten Untersuchungen waren die Vakzinierungen bei zehn Patienten beendet, von denen je fünf aus dem Montanide- und fünf aus dem GM-CSF-Studienarm stammten. An Tag 0 und bei jeder weiteren Vakzinierung waren den Patienten Blutproben entnommen worden, aus denen die Lymphozyten isoliert wurden. Diese eingefrorenen Zellen wurden nach dem Auftauen mit den Impfpeptiden der HLA-Klasse I und II präsensitiviert und ihre IFNg-Sekretion 12 Tage später nach einer erneuten Peptidstimulation in Elispot-Assays analysiert. Zusätzlich wurden die CD8+ T-Zellen in Tetramer-Färbungen und die CD4+ T-Zellen in intrazellulären Zytokinfärbungen untersucht. Die Vakzinierungen induzierten einzelne HLA-Klasse-I-Antworten, von denen sich die meisten gegen ein Impfpeptid von Cyclin D1 richteten. Die Antworten traten zwischen der 6. und 10. Vakzinierung auf und waren insgesamt sehr schwach ausgeprägt. Gegen drei weitere HLA-Klasse-I-Peptide wurde bei je einem Patienten eine T-Zellinduktion gezeigt, während für die anderen sechs HLA-A*02-Peptide und die elf Peptide anderer HLA-Restriktionen keine Antworten gesehen wurden. Wesentlich stärkere Antworten wurden dagegen mit den HLA-Klasse-II-Peptiden erzielt. Die Peptide von Cyclin D1 (CCND1) und der Carboanhydrase 9 (G250) wurden bei fast allen Patienten im Elispot und in der intrazellulären Färbung ab der 2.-4. Vakzinierung positiv getestet. Für das Peptid der Matrix-Metalloproteinase 7 konnte bei keinem Patienten eine T-Zellinduktion gezeigt werden. Die CCND1-spezifischen CD4+ T-Zellen konnten bei einem Patienten mit einer sehr starken IFNg-Sekretion auch in einem ex-vivo-Elispot nachgewiesen werden, wobei ihre Frequenz deutlich niedriger als nach Präsensitivierung war. Die CD4+ T-Zellen produzierten nach Stimulation mit CCND1 und G250 nicht nur vermehrt IFNg, sondern auch IL-5 und IL-10. Um welche Zellpopulationen es sich dabei handelt und welche Bedeutung sie für den klinischen Verlauf haben, ist zum jetzigen Zeitpunkt noch unklar. Ob die Patienten auch klinisch von den Vakzinierungen profitieren, kann erst nach Auswertung aller 40 im Studienprotokoll vorgesehenen Patienten abschließend bewertet werden.

In the present work T cells from patients with advanced renal cell carcinoma were analysed before and after immunotherapy which consisted of several peptide vaccinations as adjuvant treatment after surgery. The study is a cooperation between the Clinic for Urology and the Institute for Cell Biology, Department of Immunology both of the University of Tübingen. The patients were subdivided into an HLA-A*02-positive and -negative group according to their HLA-type and then randomised into two arms. In the first arm they received intradermal injections of several peptides and GM-CSF as adjuvant whereas patients in the second arm had subcutaneous injections of peptides emulsified in Montanide. A mixture of 10 peptides, derived from tumor-associated antigens, was administered in the group of HLA-A*02-positive patients. For other HLA-types an individual set of peptides was applied. If patients were clinically stable they received up to 18 vaccinations over the course of one year. At the time of this work 10 patients out of 40 had finished their vaccination scheme. Blood samples had been taken at Day 0 and after every vaccination out of which lymphocytes were isolated and frozen. For T cell monitoring these cells from different time points were thawed. Because of their low frequencies specific T cells had to be stimulated with the same peptides that had been used in vaccination and after 12 days of pre-sensitization their IFNg-secretion was tested in Elispot-assays after another stimulation with the peptides of interest. Additionally, T cells were analysed using Tetramer stainings for CD8+ T cells and intracellular cytokine stainings for CD4+ T cells. It could be shown that the vaccinations with HLA-Class I-peptides induced some responses, out of which Cyclin D1 was the most frequently found. Responses appeared around the 6th to 10th vaccination and were in general quite weak. Three more HLA-Class I-peptides were found to be positive after vaccination in just one patient. For the rest (6 HLA-A*02-peptides and 11 peptides of other restrictions) no T-cell responses could be detected. In contrast strong responses to HLA-Class II-peptides were found in all but one patient and were mainly directed against peptides from Cyclin D1 (CCND1) and Carboanhydrase 9 (G250). The increased IFNg-secretion after stimulation with these peptides was detected by Elispot as well as intracellular staining as early as from 2nd to 4th vaccination on. The peptide of Matrix-Metalloproteinase 7 showed no T cell induction at all. In a patient with a very strong response to CCND1 specific CD4+ T cells could also be found in an ex-vivo-Elispot, although their frequencies were a lot lower. Cytokine stainings revealed that after stimulation with CCND1- and G250-peptides CD4+ T cells didn’t only produce increased levels of IFNg but also of IL-5 and IL-10. Which population is responsible for this observation and if it is of any clinical relevance remains unclear until now and has to be further investigated. At this point it can be concluded that the vaccinations have induced T-cell responses, which were more pronounced in the case of HLA-Class II. The clinical outcome will be evaluated when the data of all 40 patients are available.