Identifizierung neuer Antigen-/Antikörpersysteme bei Patienten mit autoimmuner Hepatitis

Abstract

Hintergrund: Autoantikörper spielen bei der Diagnostik und Klassifikation der autoimmunen Hepatitis (AIH) eine wichtige Rolle. Darüber hinaus wird über eine eventuelle Bedeutung von Autoantikörpern bei der Pathogenese der Erkrankung spekuliert. Bei der AIH Typ III kommen Autoantikörper gegen Leber-/Pankreas (LP)- bzw. ein lösliches Leber-Antigen (SLA) vor. Diese Autoantikörper sind krankheitsspezifisch und reagieren im Westernblot unter Verwendung eines 100 000g Überstandes aus Rattenleber mit einem 52 kDa Protein, das mittlerweile als UGA-Suppressor Transfer RNA (tRNA) assoziiertes Protein (tRNP(Ser)Sec) identifiziert wurde. Seren von Patienten mit AIH Typ III erkennen jedoch weitere Proteine, u.a. eine 48 kDa Determinante, die bisher nicht identifiziert werden konnten und auch mit Seren von Patienten beobachtet wurden, bei denen klinisch/histologisch die typische Konstellation einer AIH vorlag, die bisher bekannten relevanten Autoantikörper aber fehlten. Ziel der vorliegenden Arbeit war daher, diese Reaktionsmuster besser zu definieren und hinsichtlich ihrer Spezifität für eine AIH zu überprüfen. Methoden und Ergebnisse: Seren von 11 Patienten mit anti-LP/SLA positiver AIH III sowie von 27 Patienten mit klinisch/histologisch hochgradigem Verdacht auf AIH (n=27) und 58 Patienten mit AIH Typ I wurden im Westernblot gegen den 100 000g Überstand aus Rattenleber getestet. Als Kontrollgruppen dienten Seren von 6 Patienten mit primär-biliärer Zirrhose sowie von 35 Blutspendern. In Seren der AIH III-Patienten wurden neben Antikörpern gegen die LP/SLA-assoziierte 52kDa Determinante weitere Antikörper gegen 66, 60, 48 und 35 kDa-Proteine beobachtet. Weitere Aufreinigung über Sucrosedichtegradientenzentrifugation ergab eine Anreicherung der 66, 48 und 35 kDa Proteine in einer 1.14-Gradientenfraktion, die für weitere Untersuchungen eingesetzt wurde. 45% der Seren der AIH Typ III- Patienten und 81 % der Seren der Patienten mit v.a. AIH reagierten mit der 66 kDa Bande. Zusätzlich kamen bei diesen Patienten gehäuft Reaktionen im Bereich 48kDa (45% bzw. 37%) und 35 kDa (55% bzw. 37%) vor. Patienten mit AIH Typ I hatten Antikörper gegen das 66 kDa Protein in 9% und gegen das 35 kDa Protein in 3% der Fälle. Gesunde Kontrollen waren negativ; von den sechs PBC-Patienten hatten zwei (33%) Antikörper gegen die 66 und/oder die 48 bzw., 35 kDa-Determinante, und bei diesen Patienten bestand klinisch der Hinweis auf ein Überlappungssyndrom mit einer AIH. Um die Antigene besser zu charakterisieren, wurden die entsprechenden Proteinbanden aus den SDS-Gelen ausgeschnitten und einer massenspektrometrischen Analyse unterworfen. Ferner wurde das 66 kDa-Protein über Immunpräzipitation isoliert und ebenfalls der massenspektrometrischen Analyse zugeführt. Diese Untersuchungen führten aber bisher zu keinen aussagekräftigen Ergebnissen. Schlussfolgerung: Die in dieser Arbeit vorgelegten Ergebnisse zeigen, dass bei Patienten mit AIH Typ III weitere Antikörper vorkommen, die mit Proteinen bei 66, 48 und 35 kDa reagieren. Da dieselben Antikörper auch bei Patienten zu beobachten waren, bei denen der hochgradige Verdacht auf eine AIH bestand, jedoch alle bisher bekannten Autoantikörper negativ waren, könnte es sich um ‚neue’ Markerantikörper handeln, die die Definition einer weiteren Subgruppe von Patienten mit AIH erlauben und damit helfen, die serologische Diagnose der AIH zu verbessern. Die Identifizierung dieser Proteine auf molekularer Ebene steht jedoch noch aus.

Background: Autoantibodies play in the diagnosis and classification of autoimmune hepatitis (AIH) an important role. In addition to that, there is speculation about a possible role of autoantibodies in the pathogenesis of the disease. In AIH type III autoantibodies against Liver-/pancreas (LP) - or a soluble liver antigen (SLA) occur. These autoantibodies are disease specific and react in Western blot using a 100 000g supernatant from rat liver with a 52 kDa protein, which is identified as a UGA-suppressor transfer RNA (tRNA)-associated protein (tRNP (Ser) Sec). Sera from patients with AIH type III however identify other proteins including a 48 kDa determinant in western blot. This determinant could not be identified yet and observed with sera from patients, with clinically / histologically typical constellation of AIH but without the previously known typical autoantibodies. The aim of this study was to define this new reaction patterns and to review their specificity for AIH.

Methods and results: Sera from 11 patients with anti-LP/SLA positive AIH III and from 27 patients with clinically / histologically highly suspected AIH (n = 27) and 58 patients with AIH type I were tested in a Western blot against the 100 000g supernatant from rat liver. Sera from 6 patients with primary biliary cirrhosis, and 35 blood donors served as a control group. In sera of AIH-III patients were observed in addition to antibodies against the LP / SLA-associated 52kDa determinant, antibodies against 66, 60, 48 and 35 kDa proteins. Further purification on sucrose gradient centrifugation led an accumulation of the 66, 48 and 35 kDa proteins in a 1.14-gradient fraction, which was used for further investigations. 45% of the sera of AIH type III patients and 81% of the sera of patients with suspected AIH reacted with the 66 kDa band. Additionally to that we found in these patients frequently responses at 48kDa (45% or 37%) and 35 kDa (55% or 37%). Patients with AIH type I had antibodies against the 66 kDa protein in 9% and against the 35 kDa protein in 3% of cases. Healthy controls were negative. In the group of the six PBC patients two (33%) had antibodies against the 66 and / or 48 or 35 kDa determinant. In these two patients was clinically suspected an overlap syndrome with AIH. To characterize these antigens better, the corresponding protein bands from SDS gels cut out and subjected to mass spectrometric analysis. Furthermore, the 66 kDa protein was isolated by immunoprecipitation and also analysed with mass spectrometry. But this research led to so far to no meaningful results. Conclusion: This study shows that in patients with AIH type III further antibodies that react with proteins at 66, 48 and 35 kDa exist. The same antibodies were also seen in patients with a high suspicion of AIH, but with negative previously known autoantibodies. Therefore the described reactions could bee 'new' marker antibodies, which allow the definition of a new subgroup of patients with AIH. This could be helping to improve the serological diagnosis of AIH. The identification of these proteins on a molecular level is still pending.