Weiterentwicklung und Evaluierung eines DNS-Microarrays zur Identifikation von humanpathogenen Pilzen

Abstract

Invasive Mykosen stellen eine wachsende Gefahr, insbesondere für immunsupprimierte Patienten, dar. Dabei hängt die Prognose wesentlich von einer umgehend eingeleiteten spezifischen Therapie auf der Basis einer schnellen und präzisen Diagnose ab. Die bisherigen diagnostischen Methoden sind jedoch zeitaufwendig und die Ergebnisse oft zu unspezifisch. Der 2004 am ITB Stuttgart entwickelte Oligonukleotid-Microarray zur Detektion von humanpathogenen Pilzen (Leinberger, 2004) ist in der Lage, ausgewählte Candida- und Aspergillusspezies schnell und zuverlässig zu identifizieren. In der vorliegenden Arbeit wurde dieses System von 12 Spezies aus 2 Gruppen auf 40 Spezies aus 15 Gruppen erweitert. Ein besonderer Schwerpunkt lag dabei auf den klinisch immer bedeutsamer werdenden Zygomyceten, von denen folgende Vertreter aufgenommen wurden: Absidia corymbifera und Absidia glauca, Mucor hiemalis, Rhizomucor pusillus, und Rhizopus oryzae. Für die DNS Extraktion aus den Pilzzellen wurde ein neues Protokoll verwendet, dass die Arbeitszeit von vier auf eine Stunde verkürzte. Das Extraktionsergebnis wurde dadurch nicht beeinträchtigt: Aus allen Spezies konnte DNS in ausreichender Menge isoliert werden. Um den optimalen Versuchsaufbau zu finden, wurden alle wichtigen Größen variiert: das PCR-Kit, die Konzentration der Hybridisierungspuffer SSPE und SDS, die Hybridisierungstemperatur und die Vorbereitung der DNS auf die Hybridisierung durch Denaturierung oder Fragmentierung. Aufgrund der Ergebnisse dieser Versuche wurden folgende Standardbedingungen für diese Arbeit formuliert: Die Markierungs- und Amplifizierungs-PCR wurde mit der Taq DNA-Polymerase (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) durchgeführt. Anschließend wurde das PCR Produkt aufgereinigt, denaturiert und bei 53°C für zwei Stunden hybridisiert. Der Microarray wurde mit Referenzstämmen für alle Zielspezies und zusätzlich 48 klinischen Isolaten validiert. Dabei wurden alle Zielspezies auf Speziesebene identifiziert. War das Isolat keine Zielspezies aber aus einer Zielgruppe des Microarrays, so wurde es auf Gruppenebene erkannt. Nicht-Zielspezies erzeugten keine relevanten Kreuzhybridisierungen. Durch die Einführung der Tiefseehefe Rhodosporidium sphaerocarpum als internem Standard ist es möglich geworden, Mischungen zu identifizieren, relative Signale der einzelnen Spezies zu berechnen und eine näherungsweise Aussage über das Mischungsverhältnis zu treffen. Die Versuche zur Sensitivität des Microarrays zeigten, dass er in der Lage ist, DNS in der Menge von zehn Genomen zu detektieren. Eine weitere Validierung des Systems mit Blut- oder Gewebeproben war im Rahmen dieser Arbeit nicht möglich. Dennoch hat sich der Microarray durch die Ergebnisse dieser und anderer Arbeiten (Leinberger, 2004; Hsiao, 2005; Huang, 2006) als zuverlässige, schnelle und anpassungsfähige Methode für die mykologische Diagnostik empfohlen.

Invasive mycosis is an increasing threat, especially for immunocompromised patients. The prognosis depends on a fast and precise diagnosis, so that the correct therapy can be initiated quickly. Conventional diagnostic methods however, are time-consuming and often too unspecific. The DNA Microarray that has been developed by the ITB Stuttgart in 2004 (Leinberger, 2004) is able to identify 12 Candida and Aspergillus species clearly and fast. We now expanded this system of 12 species out of 2 groups to 40 species out of 15 groups. A special focus was laid on Zygomycetes, a group of increasing clinical importance. This group is now represented by the species Absidia corymbifera, Absidia glauca, Mucor hiemalis, Rhizomucor pusillus and Rhizomucor oryzae. The DNA extraction followed a new protocol that shortened the extraction time from four hours to one, without affecting the results. We were able to isolate a sufficient amount of DNA from each species. To optimize the procedure, all important factors were varied: the PCR-kit, the preparation of the DNA for hybridization by denaturation or fragmentation, the temperature during hybridization and the concentration of the buffers SSPE and SDS during hybridization. These experiments resulted in the following standard-conditions: the PCR for labeling and amplifying was performed with the Taq DNA-Polymerase (Eppendorf, Hamburg, Germany). The purification and denaturation of the PCR product was followed by two hours of hybridization at 53 °C. The microarray was validated with reference strains for all target species and additional 48 clinical samples. All target species were identified on species level. Species that did not belong to the target species but to one of the target groups were identified on group level. Non-target species did not produce relevant cross hybridization. By introducing the deep sea yeast Rhodosporidium sphaerocarpum as an internal standard, it became possible to identify mixtures, calculate relative signals of the individual species and give an estimate of the mixing ratio. The experiments on sensitivity showed, that the microarray is able to detect an amount of DNA that equates to ten genomes. A further validation of the system with blood or tissue samples was not possible at that moment. However the microarray has proved by these results and those published in other papers (Leinberger, 2004; Hsiao, 2005; Huang, 2006) to be a reliable, fast and adaptable method for mycological diagnostics.