Identifikation einer Zellpopulation mit Stammzellmarkern mit Korrelation zum klinischen Verlauf bei Diagnosestellung akuter kindlicher Leukämien

Abstract

Leukämische Stammzellen sind von großer Bedeutung für die Entstehung, Behandlung und gegebenenfalls Rezidiv von akuten lymphatischen (ALL) wie auch myeloischen (AML) Leukämien. Darüber hinaus scheinen sie aufgrund bestimmter Resistenzmechanismen, wie z.B. membranständiger Effluxpumpen, besonders widerstandsfähig gegenüber Chemotherapie zu sein. Daher ist ein möglicher Zusammenhang zwischen dem qualitativen und quantitativen Nachweis von LSC und dem klinischen Verlauf von Interesse. Um dies näher zu untersuchen wurden Proben von Kindern, die in den vergangenen acht Jahren an Leukämie erkrankten, durchflusszytometrisch bezüglich bestimmter Stammzell-Marker untersucht und mit dem klinischen Verlauf bzw. dem MRD- (minimal residual disease) Verlauf assoziiert.

Da leukämische Zellen Oberflächenantigene variabel und häufig asynchron exprimieren, wurden die intrazellulären Farbstoffe Hoechst 33342 und Aldefluor® in unterschiedlichen Kombinationen mit Oberflächenmarkern verwendet, um LSC zu identifizieren. Aus technischen Gründen gelang in dieser Arbeit der Nachweis der charakteristischen Side Population mit Hoechst 33342 nicht, so dass nur Aldefluor®, welches Substrat der Aldehyd Dehydrogenase (ALDH) ist, zur Intrazellulären Färbung verwendet werden konnte.

Die Ergebnisse der ALL-Patienten wurden mit dem MRD-Verlauf verglichen, da für den MRD-Level ein hoher Zusammenhang mit der klinischen Prognose nachgewiesen wurde. Es zeigte sich, dass Aldefluor® nicht generell mit der Prognose korreliert, da einige Proben eine sehr hohe ALDH-Aktivität aufwiesen. Bei dieser hohen Aktivität handelt es sich vermutlich um eine intrinsische Eigenschaft einer spezifischen Leukämieform. Dagegen konnten wir nachweisen, dass für Leukämien mit niedriger ALDH-Aktivität diese hoch signifikant mit den MRD-Werten korreliert (p < 0,001). In diesen Fällen stellt die ALDH-Aktivität wahrscheinlich eine stammzellspezifische Eigenschaft dar. Darüber hinaus konnte ein Zusammenhang zwischen der Population CD34+/CD38- und dem MRD-Level nachgewiesen werden (p = 0,02). Inwieweit es sich bei diesen Populationen um LSC handelt, muss in weiteren Versuchen gezeigt werden. Beide mit dem MRD-Level korrelierenden Populationen könnten dazu beitragen, bereits bei Diagnosestellung Informationen über die Prognose des Patienten zu erhalten.

Die Ergebnisse der untersuchten AML-Proben sind vergleichbar mit denen der ALL-Proben. Aldefluor® korreliert nur bei Proben mit geringer ALDH-Aktivität signifikant mit der Population CD34+/CD38- (p = 0,048). Diesbezügliche Korrelation mit dem klinischen Verlauf konnte aufgrund zu geringer Fallzahl nicht durchgeführt und muss in Zukunft untersucht werden. Wiederum scheint es sich bei der Enzymexpression im Fall hoher ALDH-Aktivität am ehesten um ein intrinsisches Charakteristikum der jeweiligen Leukämieform zu handeln, im gegenteiligen Fall um eine Stammzelleigenschaft. Zudem konnte für die Population CD34+/CD38-/CD45dim eine Korrelation mit dem Auftreten negativer Ereignisse wie Rezidiv oder Tod nachgewiesen werden (p = 0,042). Wie bei den Ergebnissen der ALL werden auch hier weitere Versuche diese Population genauer charakterisieren müssen.

Leukemic stem cells (LCS) are of major importance for pathogenesis, treatment and if applicable, relapse of acute leukemia, both lymphoblastic (ALL) and myeloid (AML). Furthermore, LSC seem to be particularly resistant to chemotherapy according to distinct mechanisms such as efflux pumps e.g. Therefore the relation between number and quality of LSC and the patient’s clinical progress is of interest. To investigate this relation, samples of children who were diagnosed with Leukemia within the past 8 years were analyzed for stem cell markers using flowcytogometry and then associated with the clinical or respectively MRD- (minimal residual disease) progress.

Since leukemic cells don’t follow the physiological expression of surface markers, the intracellular dyes Hoechst 33342 and Aldefluor® were used in different combinations with standard surface markers to identify LSC. However, a detection of the characteristic Side Population with Hoechst 33342 was not successful, so only Aldefluor® which is substrate to the Aldehyd Dehydrogenase (ALDH) could be used for intracellular staining.

The results of patients with ALL were compared with their MRD-progress which is known to correlate highly with clinical prognosis. A general correlation between prognosis and Aldefluor® could not be shown since there were samples with a very high ALDH-activity. This high activity is supposedly an intrinsic attribute of a particular leukemia subtype. However, in samples with low ALDH-activity the correlation with the MRD-level was highly significant (p < 0,001) and in this cases ALDH-activity can most likely be seen as a stem cell property. Also a connection between the population of CD34+/CD38- cells and the MRD-level could be shown (p = 0,02). Further investigations must prove to what extend these populations represent LSC. In any case both populations the correlate with the MRD- level could be used to obtain information on the patient’s prognosis already at the moment of diagnosis.

Among patients with AML results were similar to those with ALL. Aldefluor® only correlates in samples with lower ALDH-activity with the population CD34+/CD38- (p = 0,048). A correlation with clinical progress could not be realized due to few case numbers and is to be done in future. Like in ALL cases a high ALDH-activity probably is an attribute of a particular leukemia subtype whereas in samples with low ALDH-activity this can most likely be seen as a stem cell attribute. Additionally the Population CD34+/CD38-/CD45dim correlated with the incidence of negative events like relapse or death (p = 0,042). Similar to the results of ALL, also in AML additional investigations must characterize this population more specifically.