Chronic Inflammation of the Oral Cavity and Squamous Cell DNA Methylation

Abstract

Introduction: Worldwide oral squamous cell carcinoma (OSCC) accounts for more than 100,000 deaths per year. Chronic inflammation is considered one of its risk factors. DNA methylation may regulate gene expression and contribute to OSCC tumorigenesis. This project investigated whether chronic inflammation alters DNA methylation and expression of cancer-associated genes in OSCC. Methods: Several in-vitro models of chronic inflammation were established. Co-culture with activated neutrophils, oxidative or nitrosative stress, and interleukin (IL)-6 were tested for methylation pattern changes in OSCC cell lines. The methylation status was analyzed by pyrosequencing, methylation-specific multiplex ligation-dependent probe amplification, and sensitive melting analysis after methylation-specific PCR. Gene expression was investigated by qRT-PCR. DNA methyltransferase (DNMT)-1 and DNMT3b expression was assessed by western blot. Results: All three inflammatory models induced LINE-1 demethylation which can be interpreted as global DNA hypomethylation. CpG promoter methylation changes were observed in several tumor suppressor genes upon IL-6 treatment. In detail, CHFR, GATA5, and PAX6 altered gene expression upon change in CpG methylation. The western blot did not detect any increase in DNMT1 and DNMT3b. Conclusion: Our results indicate that chronic inflammation contributes to tumorigenesis in-vitro by altering gene methylation and consequently their expression independent of DNMT protein expression. Epigenetic gene silencing may be the consequence of chronic inflammation in the oral cavity. Both methylation and inflammation are suitable targets for developing novel preventive measures.

Einleitung: Das Plattenepithelkarzinom der Mundhöhle fordert weltweit 100.000 Todesfälle pro Jahr. Chronische Entzündung gilt als einer der Risikofaktoren. Als epigenetischer Prozess reguliert DNA Methylierung vermutlich die Genexpression und ist damit an der Tumorentstehung beteiligt. Dieses Projekt erforscht, ob chronische Entzündung Veränderung der DNA Methylierung und Expression tumor-assoziierter Gene verursachen kann. Methodik: Unterschiedliche in-vitro Entzündungsmodelle wurden etabliert. Kokultur mit aktivierten neutrophilen Granulozyten, oxidativem oder nitrosativem Stress und Interleukin (IL)-6 wurden getestet, ob diese Methylierungsveränderungen in oralen Plattenepithelkarzinom-Zelllinien hervorrufen. Der Methylierungsstatus wurde mittels pyrosequencing, methylation-specific multiplex ligation-dependent probe amplification und sensitive melting analysis after methylation-specific PCR erhoben. mRNA Expression wurde durch qRT-PCR ermittelt. Expression von DNA Methyltransferase (DNMT)-1 und DNMT3b wurden mit Western Blot untersucht. Resultate: Alle drei Entzündungsmodelle verursachten LINE-1 Demethylierung, welches auf globale DNA Hypomethylierung schließen lässt. In Zusammenhang mit IL-6 wurden aberrierende CpG Promotor Methylierungen in zahlreichen tumor-assoziierten Genen festgestellt. CHFR, GATA5 und PAX6 wiesen Genexpressionsänderungen wegen CpG Methylierungsänderungen auf. Die Western Blots zeigten keine Zunahme von DNMT1 und DNMT3b. Zusammenfassung: Unsere Daten zeigen, dass chronische Entzündung in-vitro aufgrund von Methylierungs- und Genexpressionsänderungen unabhängig von DNMT Expression zur oralen Tumorgenese beiträgt. Epigenetisches Stummschalten von Genen wird vermutlich durch chronische Entzündung verursacht. DNA Methylierung und orale Entzündung stellen gute Anhaltspunkte für die Entwicklung zukünftiger Präventionsstrategien dar.