Charakterisierung des Bax Inhibitor-1 Peptides als neues tumorassoziiertes T-Zellepitop

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URI: http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:21-opus-52560
http://hdl.handle.net/10900/45759
Dokumentart: Dissertation
Date: 2010
Language: German
Faculty: 4 Medizinische Fakultät
Department: Medizin
Advisor: Brossart, Peter (Prof. Dr.)
Day of Oral Examination: 2010-10-19
DDC Classifikation: 610 - Medicine and health
Keywords: Immuntherapie , Dendritische Zelle
Other Keywords: BI-1 , Antitumor Vakzinierung
Immunotherapy , Dendritic cells , BI-1 , TAA
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Inhaltszusammenfassung:

In der vorliegenden Arbeit wurde das neue Bax Inihibitor-1 Peptid hinsichtlich seiner Fähigkeit untersucht, in vitro eine T Zellreaktion hervorzurufen. Dies stellt die experimentelle Voraussetzung für den späteren Einsatz in Antitumor-Vakzinierungsstudien dar. Von der Arbeitsgruppe Stevanovic wurden über 70 MHC-I-gebundene Peptide von leukämischen Blasten eines AML-Patienten isoliert und analysiert. Davon wurde das HLA A24-bindende BI-1 Peptid (AYVHMVTHF) ausgewählt, da das BI-1 Protein auf Grund seiner Rolle als Apoptoseregulator ein hochinteressantes Tumorantigen darstellt. Mit Hilfe von autologen DC wurden in vitro BI-1 spezifische zytotoxische T-Zellen (CTL) induziert. Dabei wurden folgende drei Protokolle der Antigenapplikation evaluiert: DC wurden direkt mit synthetischem BI-1 Peptid beladen, DC wurden mit Gesamt-RNA von AML-Blasten elektroporiert und DC wurden mit einem in-vitro-Transkript (IVT) des klonierten BI 1 Gens elektroporiert. Anschließend wurde mittels Chrom[51Cr]-Release- und ELISPOT-Assays die Aktivität und Spezifität der induzierten CTL untersucht. Außerdem wurde mittels RT-PCR und Western-Blot Analysen die Expression des BI 1 Proteins in verschiedenen Tumorzelllinien untersucht. Bei allen drei Varianten der CTL-Induktion konnte eine antigenspezifische, HLA-restringierte Lyse nachgewiesen werden. Die CTL lysierten zuverlässig HLA A24 positive, BI-1 positive Tumorzellen. Die HLA- Restriktion wurde durch HLA-Antikörper-Blockierung nachgewiesen. Die Antigenspezifität konnte in Cold Target Inhibition Assays bestätigt werden. Auch beim Einsatz autologer DC als Targets, die entweder mit BI-1 Peptid beladen oder mit BI-1 IVT transfiziert wurden, erfolgte eine antigenspezifische, HLA-restringierte Lyse. Erwartungsgemäß wurden von DC, die mit Gesamt-RNA verschiedener leukämischer Blasten transfiziert wurden nur diejenigen lysiert, bei denen BI-1 mRNA nachgewiesen werden konnte. Zusammenfassend konnte in der vorliegenden Arbeit also gezeigt werden, dass mit dem neuen BI-1 Peptid eine antigenspezifische, HLA-restringierte T-Zellreaktion induziert werden kann. Die Charakterisierung des BI 1 Peptids als tumorassoziiertes T-Zellepitop, das eine starke Immunantwort zytotoxischer T-Zellen auszulösen kann stellt die experimentelle Voraussetzung für den Einsatz in Antitumor-Vakzinierungsstudien dar. Damit wurde die vorklinische Voraussetzung erbracht für den Einsatz des BI 1 Peptides in der onkologischen Immuntherapie.

Abstract:

Using dendritic cells (DCs) electroporated with whole RNA isolated from blasts of a patient with acute myeloid leukemia (AML), we were able to generate leukemia-specic cytotoxic T lymphocytes (CTLs) capable of recognizing the leucemic cells. To identify T-cell epitopes mediating lysis of malignant cells, peptides were eluted from the patient’s blasts and analyzed by mass spectrometry (LC/MS)-based peptide sequencing. Using this approach, an HLA-A24-binding peptide derived from Bax inhibitor-1 (BI-1), a regulator of apoptosis pathways, was identified as an epitope recognized by the generated CTLs. To further characterize this novel antigenic peptide, CTLs were induced using DCs electroporated with RNA coding for BI-1 or pulsed with the cognate peptide. These CTLs generated from healthy donors in vitro efficiently lysed the patient’s blasts as well as other HLA-matched leukemic cells. In conclusion, we identified a BI-1 peptide as a novel immunogenic tumor-associated antigen (TAA) in AML. In vitro induction of BI-1-specific CTLs by RNA transfection or pulsing of DCs with the synthetically generated peptide was a feasible and highly effective method to generate leukemia-specific CTLs. As BI-1 is (over-) expressed in a broad variety of malignancies, it may represent an interesting novel TAA in the context of cancer vaccines.

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