Aufnahme und Metabolismus von 6-Fluoro-DOPA und 6-Fluoro-Dopamin in Neuroblastomzellen und OCT-exprimierenden Zellen

Abstract

Das Neuroblastom, der häufigste extrakranielle solide Tumor des frühen Kindesalters, ist ein maligner embryonaler Tumor, der aus Zellen der Neuralleiste entsteht. Als routinemäßig eingesetztes Verfahren in der Diagnostik dieses Tumors hat sich die [123I]-mIBG Szintigrafie mittels SPECT etabliert. Das radioaktiv markierte Noradrenalin-Analogon mIBG wird von den Neuroblastomzellen über die Noradrenalintransporter (NAT) aufgenommen. Daneben gelangt diese Substanz auch in organische Kationentransporter (OCTs) exprimierende Zellen. Substanzen wie [18F]-6-DOPA und [18F]-6-Dopamin werden als Radiopharmaka bei der Positronen-Emissions-Tomografie in Kombination mit der Computertomografie (PET/CT) u.a. bei einigen neuroendokrin aktiven Tumoren in der Diagnostik und der Therapieverlaufskontrolle eingesetzt. Dopamin gelangt dabei über die NATs und die DATs in die Zellen, die aromatische Aminosäure DOPA wird über die L-Typ Aminosäuretransporter (LAT) zellulär aufgenommen. Die LATs werden von einer großen Anzahl verschiedener Gewebe exprimiert, während die NATs und die DATs ausschließlich in neuronalen Zellen vorkommen.

Exemplarisch für das Neuroblastom wurden in dieser Arbeit die beiden Zelllinien SK-N-SH und Kelly und für die OCT-exprimierenden Zellen die Zelllinien Caki-1, OCT1-HEK 293, OCT2-HEK 293 und EMT (= OCT3)-HEK 293 verwendet. Als Substanzen wurden unmarkiertes 6-FDOPA und 6-FDA und radioaktives [14C]-DOPA, durch enzymatische Decarboxylierung synthetisiertes [14C]-Dopamin und [3H]-Dopamin eingesetzt. Die aufgenommenen Konzentrationen an 6-FDOPA und 6-FDA und die weiteren Stoffwechselprodukte wurde mittels HPLC bestimmt. Bei den radioaktiv markierten Substanzen wurde mittels beta-Counter die Aufnahmeleistung der Zelllinien für die einzelnen Substanzen mit und ohne Inhibition gemessen.

Alle Zelllinien nahmen diese Substanzen auf, wobei die Aufnahme von Dopamin in die Neuroblastomzellen über die NAT (DAT) und bei den OCT-exprimierenden Zellen über die OCT erfolgte. Die aufgenommenen DOPA Konzentrationen waren höher als die von Dopamin. Innerhalb weniger Minuten wurde das von den Neuroblastom-Zelllinien aufgenommen 6-FDOPA zu 6-FDA und wahrscheinlich auch zu 6-Fluoro-Noradrenalin (6-FNA) verstoffwechselt; ebenso wurde auch das zu den Zellen gegebene 6-FDA rasch weiter metabolisiert. Da die OCT-exprimierenden Zellen über keine Enzyme der Katecholaminsynthese verfügen, konnte bei diesen Zelllinien eine solche Verstoffwechselung nicht nachgewiesen werden. Weiter wurden für die Aufnahme von [14C]-DOPA, [14C]-Dopamin und [3H]-Dopamin Hemmversuche mit 6-FDOPA, Tyrosin, 6-FDA und Desipramin durchgeführt. Die Aminosäuren 6-FDOPA und Tyrosin hemmten kompetitiv die Aufnahme von [14C]-DOPA. Ebenso kam es durch 6-FDA zu einer kompetitiven Hemmung der Aufnahme von [14C]-Dopamin und [3H]-Dopamin. Desipramin, ein selektiver Inhibitor des NAT, hemmte potent die Aufnahme von Dopamin beim Neuroblastom. Welche der beiden Substanzen als Tracer im klinischen Einsatz vorteilhafter ist, ist nicht eindeutig vorherzusagen und weitere Versuch am Kleintier-PET mit Neuroblastom-tragenden Mäusen müssen diesen Untersuchungen folgen. DOPA wird in höheren Konzentrationen unspezifischer aufgenommen als Dopamin und gelangt für diese Entität unnötigerweise durch die Bluthirnschranke, während Dopamin diese nicht überwinden kann und sich selektiv in peripheren neuronalen Zellen anreichert.

Neuroblastoma, the most common extracranial solid tumor in early infancy, is a malignant embryonal tumor derived from neural-crest cells. [123I]-MIBG scintigraphy by SPECT has established as a routine method in the diagnosis of this tumor. The radiolabeled noradrenaline analog MIBG is taken up by the neuroblastoma cells via noradrenaline transporters (NATs). Additionally, the substance enters cells which express organic cation transporters (OCTs). Substances like 6-[18F]-DOPA and 6-[18F]-dopamine are used as radiopharmaceuticals with the combined positron emission/computer tomography (PET/CT), inter alia in the diagnosis and therapy follow-up of some neuroendocrine tumors. Dopamine passes into the cells via the NATs and the DATs while the aromatic amino acid DOPA is taken up via the L-type amino acid transporters (LATs). LATs are expressed in a large variety of tissues, while NATs and DATs occur exclusively in neural cells.

In this dissertation the two cell lines SK-N-SH and Kelly were used for the neuroblastoma while the cell lines Caki-1, OCT1-HEK 293, OCT2-HEK 293 and EMT (= OCT3)-HEK 293 were used for OCT-expressing cells. The substances used were unlabeled 6-FDOPA and 6-FDA as well as radioactive [14C]-DOPA, [14C]-dopamine synthesised by enzymatic decarboxylation, and [3H]-dopamine. The 6-FDOPA and 6-FDA uptake concentrations as well as the other metabolism products were determined by HPLC. The uptake capacity of the cell lines for the radioactively labeled substances was measured with and without inhibitors by means of a beta-counter.

The substances were taken up by all cell lines, with the dopamine being taken up by neuroblastoma cells via the NATs (DATs) and by the OCT-expressing cells via the OCTs. The uptake concentrations of DOPA were higher than those of dopamine. Within few minutes the 6-FDOPA taken up by the neuroblastoma cells was metabolised to 6-FDA und probably also to 6-fluoro-noradrenaline (6-FNA); similarly the 6-FDA given to the cells was quickly metabolised. As OCT-expressing cells do not have any enzymes of the catecholamine synthesis, such a metabolism could not be detected in these cell lines. In further inhibition tests the uptake of [14C]-DOPA, [14C]-dopamine and [3H]-dopamine was determined using 6-FDOPA, tyrosine, 6-FDA and desipramine. The amino acids 6-FDOPA and tyrosine competitively inhibited the admission of [14C]-DOPA. A competitive inhibition of [14C]-dopamine and [3H]-dopamine by 6-FDA was also observed. Desipramine, a selective NAT inhibitor, potently inhibited the uptake of dopamine into the neuroblastoma. Which of the two substances is more advantageous as a tracer in clinical practice, cannot be clearly predicted and additional tests need to be carried out with neuroblastoma-bearing mice in the small-animal PET scanner. In higher concentrations the uptake of DOPA is more unspecific than that of dopamine. For this entity DOPA unnecessarily passes the blood-brain barrier while dopamine cannot pass it and accumulates selectively in peripheral neural cells.