The Repulsive Guidance Molecule-A attenuates chemotaxis induced neutrophil migration and dampens inflammation

Abstract

Guiding migrating cells towards their destination is of integral importance in cell biology. Directed migration is found in the development of the central nervous system but also in topically restricted, graded immune responses. In this context attractive environmental cues such as chemokines guiding leukocyte cell traffic have been well characterized in recent years and are likely to be complemented by repulsive cues. One such paradigm exists in the developing nervous system where neuronal migration is balanced by chemoattractive and chemorepulsive cues including the Repulsive Guidance Molecule-A (RGM-A). RGM-A is a GPI-anchored glycoprotein of 33kDa size that guides axon growth cones during neuronal development by repulsion through its receptor neogenin. Its role within the immune response remained unclear. Yet, other neuronal guidance molecules that were shown to influence leukocyte trafficking prompted a possible immunological function of RGM-A. This study reports that RGM-A is expressed in extraneuronal organs as shown by RT-PCR, Western blot and immunohistochemical staining. RGM-A inhibits leukocyte migration by contact- and chemorepulsion dose dependently through its receptor neogenin as demonstrated in transmigration assays (RGM-A 500 ng/ml 0.38±0.08, P < 0.01, 50 ng/ml 0.66±0.08, P < 0.05, 5 ng/ml 0.97±0.17, RGM-A 500 ng/ml + anti neogenin antibody 10 µg/ml 0.94±0.12). In-vivo RGM-A weakens the inflammatory response in a mouse model of zymosan-A induced peritonitis after 4 hours (migrated cells, 106: vehicle 0.55±0.18, vehicle + ZyA 2.08±0.4, RGM-A + ZyA 0.77±0.47, P < 0.05). This was confirmed by evaluating MPO levels and histological samples. The RGM-A induced reduction equally concerned all major leukocyte subtypes. RGM-A application further attenuates the pro-inflammatory response reducing cytokine levels (TNFalpha, IL-1ß, IL-6, MIP-1alpha). In contrast, the demonstrated anti-inflammatory effects of RGM-A were absent in neogenin -/- mice. Taken together, these results identify RGM-A as a protein with anti-inflammatory functions upon binding to its receptor neogenin. It effectively suppresses leukocyte recruitment supporting the idea of a molecular conserved role as guidance cue for both neurons and leukocytes. The identification of a novel endogenous inhibitor of leukocyte chemotaxis limiting infiltrating leukocyte migration creates opportunities to treat conditions caused by exacerbated or misdirected inflammatory responses.

Aktive Migration von Zellen spielt eine entscheidende Rolle sowohl während der Entwicklung des Zentralnervensystems als auch bei der Extravasation von Leukozyten, wie sie in Entzündungsreaktionen beobachtet wird. In diesem Zusammenhang wurden in den letzten Jahren Faktoren beschrieben, die die Migration von Leukozyten während entzündlicher Prozesse begünstigen, allen voran Chemokine. Es ist jedoch nahe liegend, dass Chemokine mit migrationshemmenden Faktoren in einem Gleichgewicht stehen, ähnlich wie die Migration von Neuronen während der Entwicklung des ZNS durch chemoattraktive und –repulsive Faktoren balanciert wird. Ein solcher Faktor ist das Repulsive Guidance Molecule-A (RGM-A), ein GPI-verankertes 33kDa schweres Glykoprotein mit abstoßender Wirkung auf axonale Wachstumskegel, die den Rezeptor Neogenin tragen. Die Beobachtung, dass neuronale Leitproteine auch einen Einfluss auf das Wanderungsverhalten von Leukozyten haben können, machte nun auf eine mögliche immunologische Bedeutung von RGM-A aufmerksam. Diese Studie zeigt zunächst mittels RT-PCR, Western Blot und immunhistochemischen Färbungen, dass RGM-A auch in extraneuronalem Gewebe exprimiert wird. RGM-A zeigte eine dosisabhängige hemmende Wirkung auf Leukozytenmigration durch den Rezeptor Neogenin wie in Transmigrationsassays demonstriert werden konnte (RGM-A 500 ng/ml 0.38±0.08, P < 0.01, 50 ng/ml 0.66±0.08, P < 0.05, 5 ng/ml 0.97±0.17, RGM-A 500 ng/ml + Anti Neogenin Antikörper 10 µg/ml 0.94±0.12). In-vivo, in dem Mausmodell einer Zymosan-A-induzierten Peritonitis, schwächte RGM-A die Entzündungsantwort nach 4 Std. ab (Zellzahl, 106: vehicle 0.55±0.18, vehicle + ZyA 2.08±0.4, RGM-A + ZyA 0.77±0.47, P < 0.05). Dieses Ergebnis spiegelt sich auch in MPO-Messungen und histologisch wider und betraf alle Leukozytenfraktionen in vergleichbarem Maße. Weiterhin schien RGM-A die Entzündungsantwort durch Zytokine (TNFalpha, IL-1ß, IL-6, MIP-1alpha) zu dämpfen. Die Effekte blieben in Neogenin -/- Mäusen aus. Zusammengefasst identifiziert diese Arbeit RGM-A als neuartigen körpereigenen Hemmstoff der Leukozytenmigration mit dem Zielrezeptor Neogenin. Dies unterstützt die Hypothese von evolutionär konservierten, molekularen Mechanismen der Regulation von Zellbewegung, die Leukozyten wie Neuronen betreffen. Mit der Entdeckung werden nicht zuletzt Behandlungsmöglichkeiten für Krankheiten aufgezeigt, die durch eine überschießende Immunantwort charakterisiert sind.