Verwendungsmöglichkeiten von Blutzellen in der Parkinson-Forschung

Abstract

Modelle des Parkinson-Syndroms sind wichtig, um die Ätiopathogenese der Erkrankung zu verstehen und damit möglicherweise das Spektrum der therapeutischen Optionen erweitern zu können. Bisher besteht ein Mangel an humanen Zelltypen, die für die Entwicklung eines zellulären Parkinson-Modells verwendet werden können. In der vorgelegten Arbeit wurde (in zwei weitestgehend unabhängigen Ansätzen) die Eignung von bestimmten humanen Blutzellen zur Etablierung eines zellulären Parkinsonmodells bzw. von Zellkulturen zur Erforschung der Ätiopathogenese überprüft. Teil 1: Hämatopoetische Stammzellen (HSZ) stellen ein vielversprechendes Substrat zur Entwicklung von zellulären Parkinsonmodellen dar. Vorläufige Ergebnisse hatten suggeriert, dass der Anteil an HSZ im peripheren Blut (HSZ-Anteil) bei IPS (idiopathisches Parkinson-Syndrom)-Patienten höher sein könnte als bei anderen Personen. Normalerweise müssen HSZ-Spender vorher eine Stimulation mit dem Medikament G-CSF erhalten, um aus dem peripheren Blut eine ausreichende Menge an HSZ zu gewinnen. Die Ergebnisse der vorgelegten Arbeit zeigten, dass der durchflusszytometrisch bestimmte HSZ-Anteil bei IPS-Patienten (n= 21) mit 0,00737 % etwa 2,3-fach so hoch war wie derjenige der Kontrollen (n= 9) mit 0,00315 %. Allerdings war der HSZ-Anteil der IPS-Patienten um mehr als das 13-fache vom Grenzwert von 0,1 % entfernt, ab welchem eine G-CSF-Behandlung vermieden werden könnte. Daher müssen IPS-Patienten ebenso wie sonstige Personen eine G-CSF-Behandlung erhalten, wenn sie als HSZ-Spender zu Forschungszwecken fungieren wollen. Weshalb der HSZ-Anteil bei IPS-Patienten höher war als bei Kontrollen, bleibt unklar. Für die Probandeneigenschaften Alter, Geschlecht, Leukozytenzahl und Vorliegen eines IPS konnte kein Einfluss auf die HSZ-Werte nachgewiesen werden. Teil 2: Das „Parkinson-Gen“ LRRK2 ist seit seiner Erstbeschreibung im Jahre 2004 im Zentrum des Interesses der Parkinson-Forschung, insbesondere bezüglich der Ätiopathogenese der Erkrankung. Zur physiologischen Funktion von LRRK2 gibt es erste Erkenntnisse. Zur Erforschung der LRRK2-Funktion ist es wichtig, humane Zellen zur Verfügung zu haben, die für Zellkultur-Experimente genutzt werden können. Dafür eignen sich grundsätzlich humane (mononukleäre) Leukozyten. In der vorgelegten Arbeit wurden die Leukozyten von 15 Probanden mit einem Zellsortierer in vier verschiedene Zellfraktionen getrennt, nämlich Monozyten (CD14-Zellen), B-Zellen (CD-19-Zellen) und T-Zellen (CD4- und CD8-Zellen). Anschließend wurde mittels RT-PCR („real time- polymerase chain reaction”, engl. für Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion) untersucht, ob sich die verschiedenen Zellfraktionen in ihrer LRRK2-Expression unterschieden. Dabei zeigte sich, dass Monozyten das höchste LRRK2-Expressionsniveau hatten. Das Expressionsniveau von B-Zellen (CD19-Zellen) und T-Zellen (CD4- und CD8-Zellen) betrug nur ca. 29 % bzw. 6,3 % des Expressionsniveaus der Monozyten. Damit sind Monozyten von den vier untersuchten Zellfraktionen im besonderen Maße zur LRRK2-Erforschung in Zellkultur geeignet Unter den Probanden befanden sich IPS-Patienten (n= 10) und gesunde Kontrollen (n= 5). Die beiden Gruppen unterschieden sich in keiner Zellfraktion hinsichtlich der LRRK2-Expression. Für die Probandeneigenschaften Alter, Geschlecht und Vorliegen eines IPS konnte kein Einfluss auf die Ausprägung der LRRK2-Expression nachgewiesen werden.

Sound understanding of the Parkinson’s disease’s (PD) etiopathogenesis is necessary for future development of further therapeutic options. For this purpose disease models are an important tool. There is a lack of suitable human cell types to establish an in vitro PD model. In this thesis we have examined the ability of different blood cells as a substrate for the development of a cellular PD model, respectively for the development of cell cultures dedicated to the investigation of the PD etiopathogenesis. Part 1: Haematopoietic stem cells (HSC) are generally accepted as a promising option for the development of cellular PD models. Current theories and preliminary data suggested that the fraction of HSC in peripheral blood of PD patients could be bigger than the one of healthy controls. HSC donors usually need to be stimulated with granulocyte-colony stimulating factor (G-CSF) for sufficient yield of HSC from the peripheral blood. The results of the thesis show that the HSC fraction in PD patients (n= 21) is 0,00737 % (of all leukocytes), which is approximately 2,3 times higher than the fraction in healthy controls (0,00315 %, n= 9). Yet, the PD patients’ fraction is approximately 13 times smaller than the generally accepted bench mark of 0,1 % to avoid a G-CSF stimulation. Therefore, both PD patients and healthy donors need a G-CSF stimulation to function as HSC donors (e.g. for scientific issues). The reason why the HSC fraction of the PD patients was bigger than the fraction of healthy controls remains unclear. Neither have age, sex, number of leukocytes nor presence of PD had an influence on the HSC account. Part 2: Mutations in the gene LRRK2 cause a monogenic form of PD. Since its first description in 2004 scientists have focused on LRRK2, especially in terms of the PD etiopathogenesis. There are first insights with regard to the gene’s physiological function. For further research one needs to have human cells at disposal for experiments based on cell cultures. Human (mononuclear) leukocytes are regularly used for this purpose. In this thesis leukocytes of 15 probands were separated into four fractions by cell sorting, i.e. monocytes (CD14 cells), B cells (CD19 cells) and T cells (CD4 cells and CD 8 cells). Subsequently, the single fractions have been examined by real time- polymerase chain reaction to examine if the various cell fractions have differing expression levels of LRRK2. We found out that monocytes have the highest level of LRRK2 expression. The B cells’ and T cells’ levels were only 29 % and 6,3 % respectively of the monocytes’ level. Hence, of the four examined cell types monocytes are the most promising with regard to LRRK2 research. Among the probands there were both PD patients (n= 10) and healthy controls (n= 5). Both groups showed no difference with regard to LRRK2 expression. For neither age, sex nor presence of PD influence on the LRRK2 expression could be found.