DRA (down-regulated in adenoma) – Entwicklung eines Systems für die Erforschung der Regulation des intestinalen Anionenaustauschers DRA

Abstract

DRA (down-regulated in adenoma) ist ein intestinaler Anionenaustauscher der SLC26-Familie (SLC26A3), der Cl-- und HCO3--Sekretion und NaCl-Absorption vermittelt. Er ist dabei funktionell an CFTR bzw. an NHE3 gekoppelt. DRA besitzt ein PDZ-Interaktionsmotiv zur Ausbildung von Komplexen mit Adapterproteinen, anderen Transportproteinen und Signalmolekülen. Darüber hinaus wird die Aktivität von DRA über den intra- und extrazellulären pH reguliert. Eine Punktmutation im DRA-Gen führt zur Kongenitalen Chloriddiarrhoe. Um die Regulation von DRA zu untersuchen, wurden CaCo-2-Zellen als hoch differenziertes intestinales Zellkulturmodel gewählt. DRA hat in der Zellkultur wachstumsinhibierende Eigenschaften, so dass für die heterologe Expression von DRA die Entwicklung eines induzierbaren Expressionssystems notwendig war. Daher wurden die CaCo-2-Zellen mit dem Ecdysone-induzierbaren System transfiziert. Kontrollen der Transfektionseffizienz erfolgten für alle Transfektionen über grüne EGFP-Autofluoreszenz. Eine induzierbare heterologe Überexpression von EGFP-markiertem DRA war in diesen mit dem Ecdysone-induzierbaren Rezeptor pVgRxR transfizierten CaCo-2-Zellen jedoch nicht möglich. Entweder waren die CaCo-2-Zellen nicht in der Lage, den normalerweise in humanen Zellen nicht vorkommenden Ecdysone-Rezeptor suffizient und dauerhaft zu exprimieren, oder die Transfektionseffizienz war nicht so erfolgreich wie aufgrund der fluoreszenzmikrokopischen Kontrolle angenommen. Als alternativer Ansatz wurden CaCo-2-Zellen mit dem Tetrazyklin-reprimierbaren System in Form des pTetOff-Vektors transfiziert. Anschließend wurden diese Zellen induzierbar mit EGFP-DRA transfiziert und induziert. Hier zeigten sowohl die gemischten Zellpopulationen als auch die gewonnenen klonalen Zelllinien eine grüne Autofluoreszenz, jedoch nur vorübergehend. Es konnte deutlich unterschieden werden zwischen diffus zytoplasmatisch grün fluoreszierenden EGFP-transfizierten Klonen und im Bereich der Zellmembran lokalisierter grüner Autofluoreszenz bei den mit EGFP-DRA transfizierten Klonen. Die Fluoreszenz ging jedoch nach mehrmaligem Passagieren der Zellen verloren, sodass eine induzierbare Überexpression von DRA in CaCo-2-Zellen unter den gegebenen Bedingungen nur transient erfolgreich war. Als zweiter methodischer Ansatz für die Untersuchung der Regulation von DRA durch verschiedene interagierende PDZ-Adapterproteine würde die induzierbare Expression dieser Adapterproteine in einer stabil DRA exprimierenden Zelllinie die Möglichkeit bieten, Protein-Protein-Interaktionen von DRA weiter zu erforschen. Es wurden stabil den Ecdysone-Rezeptor exprimierende EcR293-Zellen stabil mit DRA transfiziert, und damit erfolgreich funktionelle Messungen der DRA-Aktivität durchgeführt. Anschließend wurden die als Fusionsproteine mit rot fluoreszierendem DsRed klonierten PDZ-Adapterproteine EBP50 und PDZK1 erfolgreich induzierbar in EcR293-Zellen transfiziert und induziert. Die Kontrolle der Transfektionseffizienz erfolgte über die rote Autofluoreszenz von parallel mit DsRed transfizierten Zellen. Entsprechend wurden dann klonale Zellen von stabil DRA exprimierenden EcR293-Zellen induzierbar mit den Adapterproteinen EBP50 und PDZK1 transfiziert, und anschließend erfolgreich induziert. Hier fand sich fluoreszenzmikroskopisch teilweise eine Kolokalisation von rot fluoreszierenden Adapterproteinen und grün fluoreszierendem DRA, was zum einen darauf hindeutet, dass die PDZ-Adapterproteine mit DRA über dessen PDZ-Interaktionsmotiv interagieren, und was zum anderen zeigt, dass ein solches Zellmodell für weitere zellbiologische Untersuchungen zur Regulation von DRA mit fluoreszenzoptischer Methodik geeignet ist – mittelfristig sogar an lebenden Zellen, da die Eigenfluoreszenz der Tags eine Fixierung und Antikörpermarkierung überflüssig macht.

DRA (down-regulated in adenoma) is an intestinal anion exchanger of the SLC26 family (SLC26A3), that mediates secretion of Cl- and HCO3- and absorption of NaCl. It is functionally coupled to CFTR or respectively NHE3. DRA contains a PDZ interaction motif for building complexes with adapter proteins, other transport proteins and signalling molecules. Furthermore the activity of DRA is regulated by intra- and extracellular pH. A point mutation in the DRA gene leads to congenital chloride diarrhea. To analyse the regulation of DRA CaCo-2 cells as a highly differentiated cell culture model were selected. DRA has growth inhibiting characteristics in cell culture; thus for heterologous expression of DRA it was necessary to develop an inducible expression system. Therefore the CaCo-2 cells were transfected with the ecdysone-inducible system. Transfection efficiency for all transfections was checked by green EGFP autofluorescence. But inducible heterologous overexpression of EGFP-tagged DRA was not possible in these CaCo-2 cells transfected with the ecdysone-inducible receptor pVgRxR. Either the CaCo-2 cells were not able to express sufficient amounts of the ecdysone receptor which is normally not present in human cells, or transfection efficiency was not as effective as assumed based on the fluorescent microscopic controls. As an alternative approach CaCo-2 cells were transfected with the tetracycline-repressive system in form of the pTetOff vector. Subsequently these cells were inducible transfected with EGFP-DRA and induced. Both mixed clones and single clones showed green autofluorescence, but only temporarily. It could be clearly differentiated between diffuse cytoplasmic green fluorescent EGFP-transfected clones, and green autofluorescence localised in the cell membrane of the EGFP-DRA transfected clones. Fluorescence was lost after several cell culture passages; thus inducible overexpression of DRA in CaCo-2 cells was successful under the given conditions only transiently. As second methodical approach for the analysis of the regulation of DRA by different interacting PDZ adapter proteins, the inducible expression of these adapter proteins in a cell line stably expressing DRA would offer the possibility to explore protein-protein-interactions of DRA. EcR293 cells stably expressing the ecdysone-receptor were stably transfected with DRA, and functional measurements of DRA activity were performed successfully. Afterwards EcR293 cells were inducible transfected with the PDZ adapter proteins EBP50 and PDZK1 cloned as fusion proteins with red fluorescent DsRed and then induced. Transfection efficiency was checked by red autofluorescence of cells parallel transfected with DsRed. Accordingly EcR293 clones stably expressing DRA, were transfected inducible with the adapter proteins EBP50 und PDZK1, and then succesfully induced. Here a partial colocalization of red fluorescent adapter proteins and green fluorescent DRA was found, indicating on the one hand that the PDZ adapter proteins interact with the PDZ interaction motif of DRA, and on the other hand, that such a cell model is applicable for further cell biological study on the regulation of DRA with fluorescence optical methodology – in the medium term even with living cells because the autofluorescence of the tags supersedes fixation and antibody marking.