Untersuchung zur Translokation von "Yersinia outer proteins" in Wirtszellen mit Hilfe des YopE-Cre Reportersystems

Abstract

Humanpathogene Yersinien unterlaufen die angeborene Immunabwehr des Wirtes, indem sie eine Gruppe von Virulenzfaktoren, die sogenannten Yersinia outer proteins (Yop) E, T, H, M, O und P mittels eines Typ III Sekretionssystems (TTSS) direkt in Wirtszellen translozieren. Diese Yops inhibieren Wirtszellfunktionen und nehmen so negativen Einfluss auf die Immunabwehr. In diversen Studien wurden zum besseren Verständnis, wie die Yop Translokation durch das TTSS von Yersinien funktioniert, verschiedene Reportersysteme entwickelt. Ziel der vorliegenden Arbeit war es ein Reportersystem, basierend auf einem Cre YopE Fusionsprotein und lox P flankiertem Reportergenkonstrukt zu entwickeln, um in Infektionsexperimenten zunächst von kultivierten Zellen diejenigen Zellen zu erkennen, in die die Yops transloziert werden. Langfristig sollte dieses System dazu dienen, Yop Translokation im Mausinfektionsmodell nachzuweisen. Das Prinzip des Systems ist es, einen Yersinien Stamm zu generieren, der nach Kontakt mit Zellen ein YopE Cre Fusionsprotein in die Zelle injiziert. Die translozierte Cre Rekombinase deletiert dann ein Genfragment, so dass ein konstitutiv aktiver Promotorbereich in die Nähe eines für Beta-Galaktosidase kodierenden Genabschnitts gebracht wird. Nach Expression von Beta-Galaktosidase kann diese durch Färbung mit X-Gal, wobei eine Blaufärbung entsteht, nachgewiesen werden kann.

Es wurden Expressionsvektoren bestehend aus N-terminalen YopE Fragmenten (YopE138, YopE52) und einer C-terminalen NLSCre Domäne konstruiert. Durch transiente Transfektion von Zellen mit diesen Vektoren konnte gezeigt werden, dass die Funktionalität der Cre-Rekombinase durch die Fusion an die YopE Fragmente nicht beeinträchtigt wird. Die Yersinien-Stämme WA-P und WA-CpTTSS (Serotyp O:8, Typ III Sekretionssystem, aber keine Effektor-Yops) wurden mit den konstruierten Expressionsvektoren pACYC184yopE52Cre und pACYC184yopE138Cre transformiert und anschließend die Sekretion und Translokation der YopE-Cre Hybride beider Reporterstämme untersucht. Die Sekretion und Translokation der Fusionsproteine konnte für beide Reporterstämme nachgewiesen werden. Hierbei zeigte sich, dass der Reporterstamm WA-C(pTTSS) eine höhere Sekretions- und Translokationseffizienz aufweist als der Reporterstamm WA-P, der zusätzlich zum YopE-Cre Fusionsprotein weitere zytotoxische Effektor-Yops sekretiert. In vergleichenden Untersuchungen der Translokation der YopE-Cre Hybride konnte gezeigt werden, dass YopE52Cre besser transloziert wird als YopE138Cre. Dies entspricht den Untersuchungen von Feldmann et al mit YopE DHFR Hybriden. Zur quantitativen Auswertung der Translokation von YopE-Cre in Zellen nach Yersinien Infektion wurde weiterhin eine auf Druchflusszytometrie basierende Methode etabliert. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass in der vorliegenden Arbeit ein Reportersystem etabliert werden konnte, das zur Untersuchung der Translokation von Yops prinzipiell geeignet ist. Allerdings ist der Anteil an Zellen, in denen Yop Translokation mit Hilfe des YopE-Cre Systems nach Infektion nachweisbar ist, mit weniger als 10 % relativ gering. In nachfolgenden Arbeiten konnte das System weiter optimiert werden, erwies sich aber für in vivo Untersuchungen als unzureichend. Auch Untersuchungen von Briones et al zum Proteintransfer über das TTSS von Salmonella enterica basierend auf einem SopE-Cre Reportersystem bestätigten retrospektiv, dass das Cre-System als Reportersystem zum Nachweis von Proteintranslokation durch TTSS-Systeme für in vivo Modelle wenig geeignet ist.

Pathogenic yersiniae are able to resist the innate immune defense of their human host by injection of a set of anti-host proteins, called Yops via type III secretion (TTSS) mechanism into host cell. These proteins have the capacity to modulate or interfere with a variety of cellular functions. In several studies the transfer of proteins by the TTSS system has been monitored with a variety of reporter systems. In this study a reporter system based on a YopE-Cre fusion protein and a loxP flanked lacZ reporter gene was used to detect in cell culture experiments the cells, in which Yops have been injected. Based on long-term considerations this system was supposed to be used to detect Yop translocation in experimental mouse infection model. Principle of this system is to generate a Y. enterocolitica strain expressing a YopE-Cre fusion protein. The CV1 5B fibroblasts carry the reporter gene lacZ in which the expression of lacZ is conditional to the removal of a loxP flanked intervening sequence upon expression of the Cre recombinase. After cell contact Y. enterocolitica is injecting the YopE-Cre fusion protein directly into host cells, and depending on the Cre recombinase activity the lacZ gene is expressed. After lacZ expression beta-galactosidase activity can be detected by x-Gal staining, which forms an intense blue precipitate. Plasmids were constructed by fusing YopE fragments of Y. enterocolitica of the N-terminus (YopE138, YopE52) in frame with full length sequence of the P1 Cre recombinase. Transient transfection of these plasmids shows that YopE Cre retains efficient recombinase activity. Yersiniae strains WA-P and WA-CpTTSS (serovar O:8, typ III secretions¬system, but no effektor-Yops) were transformed with pACYC184yopE52Cre and pACYC184yopE138Cre and then secretion and translocation of YopE-Cre fusion proteins were tested. In both yersiniae strains secretion and translocation of YopE-Cre could be shown. The results indicated that strain WA-C(pTTSS) is more efficient in secretion and translocation compared to strain WA-P, which additional secrete further effector Yops. In line with analysis by Feldman et al with YopE-DHFR hybrid proteins, comparative experiments of translocation of YopE Cre fusion proteins indicate that YopE52Cre is better translocated than YopE138Cre. To quantify cell numbers of YopE-Cre translocation after Yersinia infection a flow cytometry based method was established.

Taken together, in this study a reporter system in principle enable to detect Yop translocation could be established. Certainly the quantified fraction of cells in which Yops were translocated after infection using the YopE-Cre reporter system is with 10 % relatively low. Based on the studies performed here the YopE-Cre system was optimized, but the results indicated that it is not suitable for in vivo analysis. Also Briones et al affirmed with the study about monitoring protein transfer via TTSS by Salmonella enterica using a SopE-Cre reporter system that the Cre-system as a reporter system for quantitative detection of targeted cells in in vivo models is not suitable.