Implementierung, Evaluation und vergleichende Untersuchungen des Powerplex 16 Systems zur quantitativen Chimärismusanalyse

Abstract

Die allogene Stammzelltransplantation ist ein Verfahren zur Therapie verschiedener maligner und nicht-maligner hämatologischer Erkrankungen. Da es sich um eine sehr aufwendige Therapie handelt, sind Methoden, die den Behandlungsverlauf dokumentieren, wie minimale Resterkrankung und Chimärismusanalyse, essentiell. Eine nach Stammzelltransplantation vollständig vom Spender abgeleitete Hämatopoese ist Voraussetzung für das Engraftment und die Prophylaxe eines Rezidivs der zugrundeliegenden Erkrankung. Die qualitative und quantitative Untersuchung der donor- und rezipientenspezifischen Zellen wird als Chimärismusanalyse bezeichnet. Chimärismusuntersuchungen sind deshalb zur Identifizierung und Prognose einer erfolgreichen Stammzelltransplantation von großer Bedeutung. Die Identifizierung oder Diskriminierung der Spender und Empfängerzellen anhand ihres genetischen Aufbaus ist das zugrundeliegende Prinzip der Chimärismusanalyse. In den letzten Jahren wurden verschiedene Methoden wie Erythrozytenphänotypisierung, RFLP (Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus) und FISH (Fluoreszenz in situ Hybridisation) sowie die quantitative real-time PCR zur Chimärismusanalyse etabliert. Die Bestimmung des Genotyps mittels der STR-PCR mit fluoreszenzmarkierten Sonden und anschließender Auftrennung durch Kapillarelektrophorese wird als erfolgreichste und stabilste Methode zur Detektion des Chimärismus angesehen. Im Rahmen dieser Promotionsarbeit wurde ein aus der forensischen Medizin zur Identifizierung des genetischen Fingerabdrucks bekanntes STR-Primersystem bestehend aus 15 Markern und das zur Geschlechtsdifferenzierung verwendete Amelogenin für die quantitative und qualitative Chimärismusdiagnostik nach allogener Stammzelltransplantation etabliert. Die Informativität wurde mittels eines durch das Eurochimärismus-Konsortium festgelegten "RSD-Codes" ermittelt. Die 15 hier getesteten hochpolymorphen Marker konnten in 98,3% des Patientengutes präzise zwischen Donor und Rezipient diskriminieren. Mit der STR-PCR ist unabhängig von Geschlecht, Blutgruppe und Grad der Übereinstimmung im HLA-System für annähernd jedes Patientenpaar eine Chimärismusanalyse nach Stammzelltransplantation möglich. Die durchschnittliche Sensitivität der Multiplex-Marker wurde in Standardverdünnungsreihen ermittelt und variiert für jedes Patientenpaar zwischen 5,57 und 13,22% bei einem mittleren Detektionslimit von 8,74%. Es zeigte sich, dass die Nachweisgrenze vom verwendeten Primer und dem zugehörigen Patientenpaar abhängt; die Bandbreite der einzelnen Primer bezüglich der Sensitivität reicht von 0,4% bis maximal 22,1%. Für die uns durch das Eurochimärismus-Konsortium gesondert zugewiesenen Primer D3S1358 und D21S11 wurde in Standardverdünnungsreihen eine Sensitivität von 2,2 bis 16,4% ermittelt, bei einem durchschnittlichen Detektionslimit von 6,4%. In unseren Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass Marker, die von einer stutter-peak-Formation betroffen sind sowie heterozygote Allelkonstellationen eine geringere durchschnittliche Sensitivität erzielen. Bei der Auswertung der Ergebnisse muss daher durch einen erfahrenen Untersucher der passende Primer für das jeweilige Donor-/Rezipientenpaar gewählt werden. Summa summarum ist das aus der Forensik stammende Powerplex 16-System eine informative und sensitive Methode für die Chimärismusdiagnostik, die auf nahezu alle Patienten angewendet werden kann. Es bietet einen schnellen Überblick über 15 STR-Marker, so dass eine aufwendige Primersuche mit diesem System entfällt.

Allogenic HSCT is a treatment modality for various malignant and non-malignant hematological disorders. Due to its complexity HSCT treatment essentially requires methods to document therapeutic success like minimal residual disease and chimerism monitoring. In human HSCT complete donor-derived hematopoiesis is considered necessary for sustained engraftment and prevention of relapse of the underlying disease. Qualitative and quantitative examination of donor- and recipient-specific cells in recipients peripheral blood and bone marrow is called chimerism analysis. Chimerism-monitoring therefore plays a crucial role in identifying/predicting the success or failure of HSCT. Its underlying principle is the differentiation of donor and recipient cells based on their genetic profile. In recent years, various methods have been established for chimerism analysis including erythrocyte phenotyping, RFLP (restriction fragment length polymorphism) and FISH (fluorescence in situ hybridization) as well as quantitative real-time PCR. Fluorescent primer-based PCR genotyping of highly polymorphic short tandem repeats (STRs) with consecutive capillary electrophoresis is widely accepted as the most valuable and robust technique for the detection of chimerism. In this study we established a primer-system for forensic genetic fingerprinting consisting of quantitative and qualitative chimerism analysis after allogenic stem cell transplantation. The system includes 15 markers and Amelogenin, a substance used for the differentiation of sex. A RSD-(Recipient-Shared-Donor) Code has been defined by the Eurochimerism consortium based on which we determined the system´s informativeness. These 15 highly polymorphic markers were shown to discriminate between donor and recipient in 98,3% of patients tested. Because STR-PCR is independent of sex, blood type and HLA-mismatch chimerism analysis by STR-PCR is possible for almost every patient. The mean sensitivity of the multiplex markers has been determined by standardized dilution series and was demonstrated to vary between 5,57% and 13,22% for each recipient-donor pair with an average detection limit of 8,74%. The limit of detection seems to depend on the specific primer used as well as the recipient-donor pair. The primers' sensitivities diversify between 0,4% and 22,1%. The two primers (D3S1358 and D21S11) allocated to us by the Eurochimerism consortium have shown sensitivities between 2,2% and 16,4% with an average detection limit of 6,4%. We were able to show that markers with stutter peak formations or heterozygote allelic constellation had lower average sensitivity. In conclusion the forensic Powerplex 16 system is an informative and sensitive method for chimerism analysis. It can be applied to almost every patient and provides a rapid overview of 15 STR-Markers without a necessary timeconsuming search for adequate primers.