Regulation der Insulinsekretion und Inselgröße in Wildtyp und PKC delta transgenen Mäusen

Abstract

Diabetes mellitus ist eine weltweit anzutreffende Stoffwechselstörung, die auf Grund von Beta-Zelldysfunktion und Insulinresistenz zu chronischer Hyperglykämie und in den Spätfolgen zu mikro- und makrovaskulären Schäden führt. Die Proteinkinase C Delta zählt zu den neuen Isoformen der PKC und fällt dadurch auf, dass ihre proapoptotische Wirkung vielfach nachgewiesen werden konnte. Als Reaktion auf diverse apoptotische Stimuli wird PKCDelta im Kern durch Caspase 3 gespalten, wobei das katalytisch aktive Fragment DeltaCF entsteht, welches für die Ausführung der Apoptose notwendig ist. Insbesondere konnte auch eine Rolle der PKCdelta in der Vermittlung von Interleukin-1Beta induzierter Apoptose in Beta-Zellen gezeigt werden. Ebenso ist allgemein akzeptiert, dass Fettsäuren in Beta-Zellen Apoptose auslösen. Zum einen wurde zwar gezeigt, dass Fettsäuren PKCDelta aktivieren, zum anderen hat aber die Runterregulierung der PKCDelta durch Langzeitbehandlung mit PMA (Phorbol-12-myristat-13-acetat) die Palmitat-induzierte Apoptose nicht verhindert. Auf Grund der immer noch bestehenden Unklarheit über die Rolle und Funktion der PKCDelta in der Beta-Zelle wurde in dieser Studie die Insulinsekretion und die Beta-Zellmasse in PKCDelta transgenen Mäusen untersucht. Zum einen wurde eine transgene Maus genutzt, die eine funktionslose Mutante der PKCDelta im Pankreas exprimiert, welche durch kompetitive Hemmung die endogene PKCDelta unterdrückt(PKCDeltaKN). Zum anderen wurde die Studie an einer Maus durchgeführt, die die Wildtypkinase im Pankreas überexprimiert (PKCDeltatgWT). Im ersten Teil der Arbeit wurde die Glucose-induzierte Insulinsekretion, sowie die Insulinsekretion nach Zugabe verschiedener Testsubstanzen in isolierten Inseln aus Wildtyp (WT) und PKCDeltaKN Mäusen untersucht. Hierbei fiel eine bei allen Glucosekonzentrationen höhere Insulinsekretion der PKCDeltaKN Inseln gegenüber den WT Inseln auf. Die Stimulation mit einem FFAR1 Agonisten und mit Carbachol, einem Parasympathomimetikum war nicht signifikant verändert. Auch eine maximale Steigerung der Glucose-induzierten Insulinsekretion durch Stimulation der Adenylatzyklase mit Forskolin war durch die Expression von PKCDeltaKN nicht beeinflusst. Interessanterweise wurde aber die basale Sekretion bei 2,8 mmol/l Glucose durch Fettsäuren nur in den transgenen Inseln stimuliert, was vermuten lässt, dass PKCDelta bei niedriger Glucose auf die Insulinsekretion supprimierend wirkt. Der Vergleich des Insulingehaltes der Inseln zeigte eine altersabhängige Zunahme um mehr als 100 %, aber keine Unterschiede zwischen den WT und PKCDeltaKN Mäusen. Dies zeigt auf, dass die Mehrsekretion der PKCDeltaKN Inseln nicht auf einen vermehrten Insulingehalt zurück zu führen ist. Im zweiten Tteil der Arbeit wurde durch Ausmessen der immunhistochemisch mit einem Anti-Insulin Antikörper markierten Inselfläche , die Beta-Zellmasse in WT und PKCDeltaKN Mäusen verglichen. Dabei waren 85 % aller Inseln der WT Mäuse größer als 12000 my m2, bei den PKCDeltaKN Mäusen sogar 95 % der Inseln. Dies könnte eine mögliche Erklärung für die Sekretionsunterschiede darstellen. Da für PKCDelta schon mehrfach eine pro-apoptotische Wirkung gezeigt worden ist, könnte die Hemmung von PKCDelta durch PKCDeltaKN und die dadurch reduzierte Apoptoserate eine Vergrößerung der Inseln erklären. In der Tat zeigten weitere Analyen, die in der Arbeitsgruppe durchgeführt wurden, dass in Schnitten von WT Mäusen nach HFD (hohe Fettdiät) signifikant mehr gespaltene Caspase 3 nachgewiesen werden kann als in Schnitten von WT Mäusen die Normaldiät erhielten. In Pankreasschnitten von PKCDeltaKN Mäusen nach HFD war keine Steigerung der Caspase 3 Aktivität nachzuweisen. Entsprechend war die Palmitatinduzierte Apoptose, die in isolierten Inselzellen von WT Mäusen nachgewiesen wurde in PKCDeltaKN Inselzellen gehemmt. Weitere immunhistochemische Analysen wurden mit Tieren, die für acht Wochen mit einer hohen Fettdiät (HFD) gefüttert wurden, durchgeführt. In diesem Teil der Studie wurden WT und PKCDeltatgWT Mäuse untersucht. Nach hoher Fettdiät fielen sowohl bei den WT als auch bei den PKCDeltatgWT Mäusen deutlich kleinere Inseln auf. Die meisten Inseln waren zwischen 4000 und 12000 my m2 groß und circa 30% waren sogar kleiner als 4000 my m2. Insgesamt war die Beta-Zellmasse in WT Mäusen tendenziell größer als in PKCDeltatgWT Mäusen. Zusammenfassend zeigt diese Studie, dass eine Hemmung der PKCDelta Aktivität vor Fettsäuren- und HFD- induzierter Beta-Zelldysfunktion schützt. Dabei hat PKCDeltaKN weniger einen stimulierenden Effekt auf die Insulinsekretion, sondern stabilisiert eher die Beta-Zellmasse, indem apoptotischer Zelltod durch PKCDeltaKN gehemmt wird.

Diabetes mellitus is a metabolic disease, which leades to chronic hyperglycemia via Beta-cell dysfunction and insulin resistence. The long term consequences are micro- and macrovascular damages. The protein kinase C Delta is one of the new PKCs and is outstanding because its pro-apoptotic function could be shown repeatedly . As reaction to many apoptotic stimuli PKCDelta is claeved in the nucleus by caspase 3 and the catalytic active fragment DeltaCF is generated. DeltaCF is essential for apoptosis. Also it was shown that PKCDelta plays a role in the mediation of interleukin 1 Beta-induced apoptosis of Beta-cells. Likewise it is generally accepted that fatty acids induce apoptosis in Beta-cells. On the one hand it was shown that fatty acids activate PKCDelta, on the other hand did the downregulation of PKCDelta by long-term incubation with PMA (Phorbol-12-myristat-13-acetat) not prevent palmitate induced apoptosis. Because of this still existing ambiguity about the role and function of PKCDelta in Beta-cells, in this study insulin secretion and Beta-cell mass in PKCDelta transgenic mice was examined. Two different transgenic mice were used in this study. One of them expresses an functionless mutant of PKCDelta in its pancreas, which blocks endogenous PKCDelta by competetive inhibition (PKCDeltaKN). The other one overexpresses wildtype kinase in its pancreas (PKCDeltatgWT). In the first part of the study glucose-incuced insulin secretion as well as insulin secretion after incubation with several test substances of isolated islets from wildtype and PKCDeltaKN mice was examined. Outstanding was a higher insulin secretion of the PKCDeltaKN islets compared with the WT islets at all glucose concentrations. Stimulation with a FFAR1 agonist and with carbachol, which is a parasympathicomimetic, were not significantly changed. Also was the maximal enhencement of glucose-incuced insulin secretion by stimulating the adenylate cyclase with Forskolin not influenced by experession of PKCDeltaKN. Interestingly the basal insulin secretion at 2.8 mmol/l glucose was only stimulated by fatty acides in the transgenic islets. This leeds to the assumption that PKCDelta supresses insulin secretion at low glucose levels. Comparison of the insulin content of the islets showed agerelated gain of more than 100 %, but no differences between WT and PKCDeltaKN mice. That proves that the higher secretion of the PKCDeltaKN islets is not due to an higher insulin content. In the second part of the study islet surface, which was marked by immunohistochemistry with an antiinsulin antibody, was measured and so Beta-cell mass in WT and PKCDeltaKN mice was compared. Thereby 85 % of all WT islets were bigger than 12000 my m2, among the PKCDeltaKN islets even 95 % were bigger. This could be an explanation for the differences in secretion. Given that for PKCDelta a proapoptotic effect was shown several times, the supression of PKCDelta by PKCDeltaKN and thus the reduced rate of apotosis could be an explanation for the enlargement of the islets. Indeed other analysis performed in the working group showed in histology sections from WT mice fed a high fat diet (HFD) significantly more cleaved caspase 3 than in histology sections from WT mice fed normal diet. In pancreas sections from PKCDeltaKN mice fed HFD was no increase in caspase 3 activity detectable. Accordingly palmitate-incuced apoptosis shown in isolated islets of WT mice was supressed in PKCDeltaKN islet cells. Other immunohistochemistry analysis were carryed out with animals fed a HFD for eight weeks. In that part of the study WT and PKCDeltatgWT mice were surveyed. After HFD clearly smaller islets in WT mice as well as in PKCDeltatgWT mice attracted attention. Most of the islets were ranged between 4000 and 12000 my m2 and about 30 % were even smaller than 4000 my m2. In total Beta-cell mass in WT mice was by trend bigger than in PKCDeltatgWT mice. In summary this study showes that supression of PKCDelta activity protects from fatty acide- and HFDincuced Beta-cell dysfunction. Thereby PKCDeltaKN has a stimulating effect on insulin secretion to an lesser extent than a stabilizing effect on Beta-cell mass by supressing apoptosis via PKCDeltaKN.