Vergleich von BMP-4 versus BMP-2 für die osteogene Differenzierung von Periostzellen

Abstract

Es ist heute bekannt, dass humane periostale mesenchymale Stammzellen (PMSCs) eine aussichtsreiche Grundlage für ein erfolgreiches Knochen Tissue Engineering darstellen. Dennoch ist die osteogene Differenzierung noch nicht vollständig be-schrieben. Da BMP-2 und BMP-4 nachweislich Regulatoren der Osteogenese sind, bestand die Aufgabe der vorliegenden Arbeit darin, die Wirkung derer auf die osteo-gene Differenzierung humaner PMSCs zu untersuchen. Isolierte humane PMSCs wurden mit Hilfe von osteogenem Medium mit und ohne BMP-2 und BMP-4 kultiviert. Der Nachweis der Alkalische Phosphatase Aktivität so-wie die quantitative Bestimmung der Proliferationsfähigkeit und der Genexpression wurden an Tag 5, 10 und 20 der Osteogenese durchgeführt. Die Kalziumphosphat-ablagerungen wurden mit Hilfe von Alizarin- und von Kossa Färbungen an Tag 20 qualitativ und an Tag 14, 17 und 21 quantitativ bestimmt. Die Untersuchungen ergaben zwei Gruppen von PMSCs: eine, die in vitro erfolgreich kalzifiziert ist, und eine, die zur Mineralisation nicht befähigt war. Beide wurden ver-gleichend in Hinblick auf den Einfluss von BMP-2 und BMP-4 analysiert. Das Prolife-rationsverhalten nahm im Laufe der Differenzierung ab, die Mineralisation zu. Dies konnte für die Proben, die kalzifiziert sind, mit Hilfe der beschriebenen Tests und Färbemethoden eindeutig nachgewiesen werden. Gegenteilige Ergebnisse lieferte die andere Zellgruppe. Die Genexpression bekannter osteogener Marker wie Runx2, Osteopontin, Osteokalzin und der Alkalischen Phosphatase konnten mittels quantita-tiver real-time PCR verstärkt bei den mineralisierten Proben nachgewiesen werden. Kollagen Typ I, IGF-2 und Osterix zeigten dies wider Erwarten nicht. Einzig bezogen auf die Analyse der COMP Genexpression konnte ein positiver Effekt der Morphoge-ne BMP-2 und BMP-4 nachgewiesen werden. Beim Vergleich dieser beiden Faktoren zeigte sich bei allen durchgeführten Untersu-chungen, dass weder BMP-2 noch BMP-4 eine vorteilhafte Wirkung auf die osteoge-ne Differenzierung unserer Periostzellen ausübte.

It is well known that periosteum-derived mesenchymal stem cells (PMSCs) are a promising basis for successful bone tissue engineering applications. However, the osteogenic differentiation of PMSCs has not fully been determined yet. Bone morphogenetic protein-2 and -4 (BMP-2 and BMP-4) are common regulators of the human osteogenesis. The aim of this study was to examine the effects of BMP-4 in comparison to the effects of BMP-2 on the osteogenic differentiation of PMSCs. Isolated human PMSCs were cultivated in osteogenic medium that contained known activators. After 5, 10 and 20 days of differentiation alkaline phosphatase activity was determined using a suitable staining method. At the same time, the proliferation rates were measured and gene expression patterns were quantified using real-time PCR. After 20 days of differentiation the mineralization capacity of PMSCs was detected by Alizarin and von Kossa stainings. Finally, quantification of calcium release was detected at the time points 14, 17 and 21 of differentiation. The obtained data revealed that the examined PMSCs could be classified into two cell groups: one cell group was able to mineralize in vitro (mineralizing PMSCs – mPMSCs), whereas the other one was not able to calcify (non-mineralizing PMSCs – nmPMSCs). During the differentiation process mPMSCs revealed a decreasing proliferation capacity and showed an increasing calcium deposition. In contrast, nmPMSCs maintained their proliferation capacity and no calcium deposition could be detected. Higher expression levels of Runx2, osteopontin, osteocalcin and alkaline phosphatase were detected in mPMSCs in comparison with nmPMSCs. Surprisingly, type I collagen, IGF-2 and osterix expression was higher in nmPMSCs in comparison to the mPMSCs. Gene expression patterns were generally not altered by the addition of BMP-4 in comparison to BMP-2. COMP gene expression alone was fortified by the addition of BMP-4 in comparison to BMP-2. In summary, BMP-4 showed no further benefit on the osteogenic differentiation of human PMSCs in comparison to BMP-2. Moreover, neither BMP-2 nor BMP-4 treatment of PMSCs showed a shortened or accelerated osteogenic differentiation in comparison to culture conditions using known osteogenic stimuli.