Veränderungen von Oberflächenantigenen während der Osteogenese von Periostzellen

Abstract

Periostzellen des menschlichen Kieferknochens (abgekürzt mit JPC - jaw periosteal cells) stellen eine interessante und vielversprechende Alternative zu mesenchymalen Knochenmarkzellen im praktisch angewendeten Tissue Engineering dar. In Kultur stellen JPC eine morphologisch heterogene Zellpopulation dar. Sie enthält neben den osteogenen Vorläufern weitere Zelltypen wie Gewebsfibroblasten, Muskel- und Fettzellen. Die Charakterisierung und Separation der Vorläuferzellen, die ein reproduzierbares Verhalten der Knochenbildung zeigen, ist deshalb eine große Herausforderung der zellbasierten Therapie in der Mund-, Kiefer- und Gesichtschirurgie. Um die Tissue Engineering Anwendungen mit diesen Zellen zu optimieren, werden charakteristische Marker gesucht, die zwischen den enthaltenen Zelltypen unterscheiden bzw. die Stammzellen kennzeichen. Über die Antigenpräsentation und das osteogene Differenzierungsverhalten von Periostzellen ist wenig bekannt. Das Ziel dieser Arbeit war es, einen Oberflächenmarker zu finden, der Zellen zu identifizieren vermag, die in der Lage sind osteogen zu differenzieren. Hierdurch kann die Qualität des Bone Tissue Engineerings verbessert und die Erfolgsaussichten des Einsatzes von periostalen Progenitorzellen zur Knochenregeneration erhöht werden. Die für die vorliegende Arbeit verwendeten JPC wurden in Medien kultiviert, die bekannte osteogene Faktoren enthielten. Die Fähigkeit zur Ausbildung einer extrazellulären Kalzium-Phosphat-Matrix wurde mittels Alizarin- und von-Kossa-Färbungen nach zwanzig Tagen der Differenzierung untersucht. Den Verlauf der Differenzierung bildete die alkalische Phosphatase Färbung am fünften, zehnten und zwanzigsten Versuchstag ab. Die Expression der Oberflächenantigene von JPC wurde per Durchflusszytometrie, immunhistochemischen Färbungen und mittels Western Blot analysiert. Die quantitative RT-PCR detektierte die Transskriptionsrate bekannter osteogener Gene. Wir konnten zwei Arten von periostalen Zellen unterscheiden. Die mJPC (mineralisierende JPC) bildeten während der Osteogenese in vitro extrazelluläre Kalzium-Phosphat-Präzipitate. Den Zellen der zweiten Gruppe, den nmJPC (nicht-mineralisierende JPC) war dieser Prozess nicht möglich. Bei diesen konnte keine Mineralisierung detektiert werden. Um zwischen diesen beiden Zellgruppen unterscheiden zu können, wurde die Reaktivität von acht monoklonalen Antikörpern zur Zelloberfläche mittels Durchflusszytometrie (fluorescence activated cell sorting - FACS) untersucht. Nach Beginn der osteogenen Differenzierung zeigten die mineralisierenden JPC dabei eine Induktion der LNGFR (low affinity nerve growth factor receptor) Expression. Die LNGFR Präsentation an der Zelloberfläche der nmJPC veränderte sich im Verlauf nicht oder verminderte sich sogar. Dieses Ergebnis bestätigte sich in semi-quantitativen immunhistologischen Färbungen und im Western Blot. Auch die quantitative RT-PCR zeigte signifikant höhere LNGFR Transkriptionsraten in mJPC im Vergleich zu denen in nmJPC. Diese Ergebnisse belegen, dass Periostzellen, die eine hohe LNGFR Expression in den ersten Tagen der osteogenen Differenzierung aufweisen mit größerer Wahrscheinlichkeit nach zwanzig Tagen mineralisieren, als Periostzellen, die eine niedrige LNGFR Expressionsrate aufweisen. LNGFR scheint sich als Marker zur Unterscheidung von mJPC und nmJPC in einer frühen Phase der Osteogenese von Periostzellen zu eignen und kann deshalb als früher Oberflächenmarker das osteogene Potential von Periostzellen in vitro nachweisen.

Jaw periosteum-derived cells (JPCs) represent an alternative to bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BMMSCs) for tissue engineering applications in oral and maxillofacial surgery because of their specialized function and shared origin with the defect site. Isolated JPCs comprise a morphologically heterogeneous population. There are no known specific markers that are able to distinguish between progenitors and cells of other tissue types. The aim of our study was to identify differentiation markers as predictors of JPC mineralization capacity. JPCs underwent osteogenic differentiation after cultivation in osteogenic medium containing known activators. JPC mineralization capacity was detected by alizarin and von-Kossa stainings after twenty days of differentiation. JPC antigen presentation was analysed by flow cytometry, immunohistochemistry and western blot. Gene expression was detected by quantitative PCR. We found two cell populations that differed in osteogenic potential: cells that are not able to mineralize in vitro (non-mineralizing JPCs - nmJPCs) and cells that are able to mineralize in vitro (mineralizing JPCs - mJPCs). By FACS analysis we screened a panel of eight monoclonal antibodies and found the low affinity nerve growth factor receptor (LNGFR - CD271) to be induced during the first five days of osteogenesis and that it was expressed at higher levels in mJPCs in comparison to nmJPCs. Similar results were obtained by semi-quantitative immunohistochemical stainings and western blot analyses. Quantitative PCR results showed significantly higher LNGFR transcript levels in mJPCs compared to nmJPCs. LNGFR is a differentiation marker that distinguishes between mineralizing JPCs and non-mineralizing JPCs during the first phase of osteogenesis and can therefore be considered an early surface marker of osteogenic capacity in vitro.