Hepatotoxizität definierter Plasmafraktionen

Abstract

Hintergrund: Für die Entwicklung eines praxistauglichen Bioreaktors auf Basis von kultivierten Hepatozyten zur überbrückenden Therapie beim akuten Leber-versagen, ist die Funktionalität der Zellen im anhepatischen Plasma von zentraler Bedeutung. Anhepatisches Plasma enthält freie und proteingebundene Toxine sowie Zytokine, welche diese Hepatozytenkulturen schädigen können. Daher wurde geprüft, ob sich diese Toxine und Zytokine, abhängig von ihrem Molekulargewicht und ihren physikalischen Eigenschaften, durch eine Filtration mit Plasmafiltern der Firma Gambro® aus anhepatischem Plasma entfernen lassen.

Material und Methodik: Anhepatisches, porkines Plasma wurde mit unterschied-lichen Plasmafiltern (10, 45, 100 kDa, Fa Gambro®) fraktioniert und porkine He-patozyten in Monoschichtkultur in diesen Plasmafraktionen kultiviert. Als Parameter wurden die GOT-/LDH-Aktivität und die Zellmorphologie nach 0, 4, 24, 28 h beurteilt. Weiter wurden humane Hepatozyten in fraktioniertem (5, 10, 50, 100 kDa-Filter) gesundem, humanem Serum kultiviert und die LDH-Aktivität nach 1, 3, 5 und 7 Tagen bestimmt.

Ergebnis: Bei porkinen Hepatozyten waren zum frühen Beobachtungszeitpunkt (4 h) die Enzymaktivitäten im 10 kDa-Filtrat höher als im anhepatischen Plasma und höher als bei den anderen Filtraten. Nach 24 und 48 h war dagegen die Hepatozytenvitalität in den Filtraten der 45- und 100kDa-Filter am höchsten. Im 10 kDa-Filtrat waren die Hepatozyten hinsichtlich Zellvitalität- und Aktivität nach diesem Zeitraum deutlich eingeschränkt. Die Enzymaktivität der im humanen, fraktionierten Plasma kultivierten humanen Hepatozyten war umso geringer, je niedriger die molekulare Ausschlussgrenze des jeweiligen Filtrats war.

Schlussfolgerung: Eine Filtration des toxischen, anhepatischen Plasmas kann die Zellvitalität und -aktivität verbessern. Sowohl bei porkinen als auch bei humanen Hepatozyten zeigte sich jedoch mit zunehmender Kulturdauer eine Abnahme der Zellvitalität und -aktivität bei den Plasmafiltern mit niedriger molekularer Ausschlussgrenze. Dieser Effekt ist auf den Entzug von essenziellen Aminosäuren und Proteinen zurückzuführen.

Background: For development of an applicable hepatocytes-based-bioreactor using in bridging therapy of acute liver failure (ALF), vitality and functionality of hepatocytes cultured in anhepatic plasma is of central meaning. Anhepatic plasma contains free and protein-bound toxins and cytokines which can derogate cultured hepatocytes. Therefore it had been examined whether these toxins can be removed from anhepatic plasma by plasmafiltration (using plasmafilters from company Gambro®) in dependence of their molecular weight and physically characteristics.

Material and method: Porcine anhepatic plasma was separated by several plasma filters (molecular cut-off 10, 45, 100 kDa, company Gambro®). Primary porcine hepatocytes in mono layer culture were cultured in filtrated anhepatic plasma. Morphological formation and functional and biochemical parameters (activity of GOT and LDH) of liver spheroids were evaluated over a period of 0, 4, 24, 48 hours in culture. Furthermore human hepatocytes were cultured in separated healthy human serum (5, 10, 50, 100 kDa-filters) and the activity of LDH was measured over a period of 1, 3, 5, 7 days in culture.

Results: At the early observation point LDH and GOT activities of porcine hepatocytes cultured in a plasmafiltrate separated by 10 kDa filter were higher than in unfiltered anhepatic plasma and higher than in other concentrates. In contrast after 24 and 48 hours the vitality of hepatocytes reached the peak in plasma separated by 45- and 100 kDa filters. The vitality of cells was reduced in plasma separated by 10kDa filters. The lower the molecular cut-off was the lower was the activity of human hepatocytes in human, separated serum.

Conclusion: Filtration of toxic, anhepatic plasma can improve cell activity and vitality. But porcine as well as human hepatocytes show decreasing cell activity and vitality with growing age of culture when using Plasmafiltration with lower molecular cut-off. This effect is caused by the lack of essential aminoacids and proteins.