Die Anwendung der Volumenbestimmung und der Flächendichtemessung zur Bestimmung der Inselzelldosis für die Inselzelltransplantation

Abstract

Die Transplantation von Inselzellen stellt neben der Pankreastransplantation die einzige kurative Möglichkeit zur Behandlung eines insulinabhängigen Diabetes mellitus dar. Hierfür stellt jedoch die genaue und reproduzierbare Bestimmung der Inselzelldosis in Anzahl an Inselzelläquivalente (IEQ) einen entscheidenden Faktor dar. So wurden im Rahmen dieser Arbeit zwei Methoden in der Inselquantifizierung - die konventionelle Methode der Volumenbestimmung und die von unserer Arbeitsgruppe entwickelte Methode der Flächendichtemessung miteinander verglichen. Als Grundlage hierfür diente die Auswertung von 12 experimentellen Schweineinselzellisolationen. Schweineinselzellen wurden mittels kontinuierlicher Digestions-Filtrationsmethode isoliert und als Dichtegradientenzentrifugation im COBE 2991 Cell Processor gereinigt. Die gereinigten Inselzellen wurden dann mit Dithizon angefärbt und mehrmals mit dem Mikroskop fotographiert, wobei jeweils eine unterschiedliche Bildfläche getroffen wurde. Insgesamt wurden 168 Bilder von den 12 verschiedenen Präparationen gemacht und im Anschluss mit Hilfe des Adobe Photoshop Programms analysiert. In dem experimentellen Teil vorangestellten Rechenbeispiel konnte bei einer angenommen Mengen von 10 Inselzellen gezeigt werden, dass ohne Verwendung der in einer Präparation vorkommenden natürlichen Inselgrößenverteilung keine lineare Beziehung zwischen beiden Auswertmethoden besteht. Im praktischen Teil wurde eine lineare Beziehung zwischen den beiden Verfahren über einen breiten Bereich an IEQ aus 12 verschiedenen Schweineinselzellpräparationen gefunden. Hierbei betrug der Korrelationskoeffizient 0,94 bei einem Regressionskoeffizienten von 0,97+/-0,03. Ein mathematischer Zusammenhang zwischen beiden Methoden konnte hierbei nicht festgestellt werden. Allerdings konnte gezeigt werden, dass die Häufigkeitsverteilung der Inselzellen bei der Berechnung des Inselvolumens durch die Flächendichte den stetig steigenden Einfluss des Volumens in der klassischen Berechnung der IEQ kompensiert und als Korrekturfaktor dieser beiden Methoden dient. Damit gelingt der Nachweis der grundsätzlichen Anwendbarkeit der Flächendichtemessung zur Dosisbestimmung von Inselzellen. Zusätzlich liefert diese Arbeit auch Daten zu den Anwendungsgrenzen der Technik, die in der Praxis von Bedeutung sein können. So konnte gezeigt werden, dass bei einem erhöhten Vorkommen von großen Inselzellen in der Präparation die Flächendichtemessung nicht mehr mit der prozentualen Bildfüllung korreliert und so zu einer extremen Unterbewertung der Inselzelldosis als IEQ führt. Weitere Fehlermöglichkeiten der Flächendichtemessung durch den Einfluß des Alters der Versuchstiere sowie des Bereichs der Inselzellen innerhalb des Pankreas wurden diskutiert.

Precise quantification of islet mass as islet equivalent (IEQ) is a crucial part of quality control and adequate characterization/normalization of islet preparations in relation to good manufacturing pratice (GMP) criterions. So, a well defined dose and potency of the transplanted mass is very important . Because of an irregular form of islets the standard method which is based on manual analysis is often prone to operator-dependent variability and missing repeatabilty. Therefore, we developed a new method without sizing and counting individual islets. The aim of the study was the establisment and validation of this method, especially the finding of corrector factors between both methods and its practical application. Porcine Islets were isolated by continous digestions-filtration method and purified by density gradient centrifugation in a COBE 2991 cell seperator. After staining of the purified islets with dithizone they were repeatedly pictured under the microscope with random area selection (totally 168 pictures from 12 different islet preparations). The stained islets were analyzed by digital image analysis with the Adobe Photoshop program and IEQ number was determined by Conventional Analysis and Areal Density Measurement. There is a good linear relation with a correlation coefficient of 0,94 and a regression coefficient of 0,97+/-0,03. The areal density measurement per picture was about 11 times faster than Conventional Analysis. The frequency distribution of islets in the distinct size classes could be found as a correctur between both mathematical different methods. Regarding islets smaller than 50 µm, IEQ number was approx. 12% too low using Conventional Analysis. Areal density measurement is a time-saving, objective and retrospective reproducible method for the assesment of transplanting islet mass. Failures and limitations of this method are found at an increased existance of large islets in the preparation (underestimation of the islet mass as IEQ because of missing correlation of areal density measurement with percental picture filling) such as of the age of the animals and the place of islets within the pancreas.