Untersuchung von genetischen Polymorphismen im Methotrexat-Stoffwechsel und -Transport bei Patienten mit primärem ZNS-Lymphom

Abstract

Das primäre ZNS-Lymphom ist eine seltene Form eines hoch-malignen, extranodalen Non-Hodgkin-Lymphoms mit steigender Inzidenz in den letzten Jahrzehnten. Hochdosiertes Methotrexat zählt bei intravenöser Verabreichung zu den wirksamsten Therapieoptionen in der Primärtherapie, allerdings mit zum Teil erheblichen Nebenwirkungen. Diese Nebenwirkungen scheinen zum Teil mit Polymorphismen in Genen des Folsäurestoffwechsels assoziiert zu sein. Fünf der Polymorphismen wurden in dieser Arbeit untersucht: Zwei in der Methylentetrahydrofolatreduktase (SNP MTHFR C677T, SNP MTHFR A1298C), einer im reduzierten Folat-Carrierprotein (SNP RFC G80A) und zwei in der Thymidylat-Synthase (TS 5’UTR 28bp tandem/triplet repeat, TS 3’UTR 1498del6). Die Punktmutationen in der MTHFR und im RFC wurden mittels Schmelzkurvenanalyse im LightCycler®, der 28 bp tandem/triplet repeat der TS mittels konventioneller PCR und Agarose Gel-Elektrophorese und die 6 bp Deletion der TS mit konventioneller PCR, Restriktionsenzymverdau durch Dra I und Agarose Gel-Elektrophorese nachgewiesen. Das Patientenkollektiv rekrutierte sich aus 156 Teilnehmern der G-PCNSL-SG-1 Studie, die sich mit dem Stellenwert der Ganzhirnbestrahlung in der Primärtherapie primärer ZNS-Lymphome mit Hochdosis-Methotrexat befasst. Von 143 Patienten wurden die Nebenwirkungen nach der WHO Skala (Grad 0 bis IV) mit jedem verabreichten Zyklus MTX erfasst. Der TT-Genotyp des SNP MTHFR C677T korrelierte signifikant mit dem Parameter „schwerste dokumentierte Nebenwirkung“ (p=0,007) und dem Parameter „nicht-hämatologische Nebenwirkung“ (p=0,007). In beiden Fällen zeigten Patienten mit dem TT-Genotyp die schwereren Nebenwirkungen. Patienten mit dem GG-Genotyp des SNP RFC G80A zeigten eine signifikant höhere Wahrscheinlichkeit (p=0,04) eine Grad III/IV Granulozytopenie zu erleiden als Patient mit mindestens einem A-Allel. Der SNP MTHFR A1298C und die Polymorphismen der Thymidylat-Synthase zeigten keine signifikante Korrelation mit den erfassten Nebenwirkungen der Therapie. Die untersuchten Polymorphismen hatten keinen Einfluß auf das overall und progression free survival. Anhand von 154 Patienten wurden für die oben genannten Polymorphismen die Allelfrequenzen innerhalb der Studienpopulation errechnet. Beim Vergleich dieser Allelfrequenzen mit denen gesunder Vergleichspopulationen zeigte sich, dass der TT-Genotyp des SNP MTHFR C677T bei Patienten kaukasischer Herkunft mit dem Risiko für ein PCNSL korreliert (p=0,04). Diese Korrelation konnte erstmals für das PCNSL aufgezeigt werden. Anderen Arbeitsgruppen war dies schon bei Lymphomen außerhalb des ZNS gelungen. Weiterhin zeigte sich, dass die homozygote Variante des triplet repeat (3R3R) der TS ebenfalls mit dem Risiko für ein PCNSL korreliert (p=0,02). Die Ergebnisse belegen, dass Polymorphismen im Folsäure- und Methotrexat-Stoffwechsel an der Krankheitsentstehung und am Auftreten von Methotrexat-induzierten Nebenwirkungen beteiligt sein können.

Primary CNS lymphoma is a rare entity of extranodal Non-Hodgkin-lymphoma. The incidence is emerging in the last decades. The antifolate methotrexate (MTX) was shown to be the single most-effective agent in first-line treatment of patients with primary central nervous system lymphoma (PCNSL) when given intravenously in high doses, however accompanied by severe side effects. These side effects are supposed to be associated with polymorphisms in genes of the folate cycle: Two in the gene of the methylenetetrahydrofolate reductase (SNP MTHFR C677T, SNP MTHFR A1298C), one in the reduced folate carrier (SNP RFC G80A) and two in the thymidylate synthase (a 6bp deletion in the 3’UTR and a 28bp tandem/triplet repeat in the 5’UTR) were studied. The SNPs in the MTHFR and RFC were analyzed by melting curve technique via LightCycler®, the tandem/triplet repeat polymorphism was conventionally analyzed by pcr and agarose gel-electrophoresis, the 6 bp deletion in TS was analyzed by pcr, adjacent enzyme digest by Dra I and following agarose gel-electrophoresis. 156 participants were recruited from the G-PCNSL-SG-1 study, which deals with the value of whole brain irradiation of PCNSL under high-dose methotrexate therapy. The therapy-related side effects of 143 participants were gathered according to the WHO (grade 0 to 4) after each administered cycle of MTX. The TT genotype of MTHFR C677T showed a significant correlation with the “maximal documented adverse reaction” (p=0,007) and the “non-hematological adverse reaction” (p=0,007). The GG genotype of SNP RFC G80A was significantly associated with a grade III/IV neutropenia in comparison to patients with at least one A-allele (p=0,04).The SNP MTHFR A1298C and the two polymorphisms in the thymidylate synthase showed no association with the collected data. Furthermore the overall survival and the progression free survival were related to the analyzed polymorphisms but showed no significant result. With the data of 154 patients allele frequencies of the aforementioned polymorphisms were calculated. The TT genotype of SNP MTHFR C677T was significantly correlated with the risk of PCNSL in a Caucasian population (p=0,04). In PCNSL this is the first evidence of this association, in other lymphoma this fact was mentioned before. Also the homozygous variant of the triplet repeat of TS (3R3R) was correlated with the risk for suffering from PCNSL (p=0,02). These results show the central role of the aforementioned polymorphisms in the folate and methotrexate metabolism and reveal that they are involved in pathogenesis of PCNSL and in occurrence of MTX-induced side effects.