Untersuchungen zum Calciumstoffwechsel an humanem Myokard in einer Mikroperfusionkammer

Abstract

Inhalt dieser Arbeit war es ein dem Herzmuskelgewebe kongruentes humanes Myokardmodell zu entwickeln und damit fluoreszenzmikroskopisch die intrazellulären Calciumregulationsmechanismen und ihre Rolle beim Reperfusionsschaden bzw. der Apoptoseinduktion zu untersuchen.

Dazu wurde eine spezielle Mikroperfusionskammer eingesetzt, in der die Kardiomyozytenzellverbände durch ein Kunststoffnetz schonend fixiert werden konnten. Für eine simultane Untersuchung von mit Fluoreszenzfarbstoff beladenen und nicht beladenen Zellverbänden wurde eine doppelt gekammerte Mikroperfusionskammer entwickelt, in der für die beiden gleichzeitig perfundierten Zellverbände die selben Verhältnisse herrschten.

Die Untersuchung der Calciumhomöostase erfolgte zunächst unter Perfusion mit Calcium-haltiger und Calcium-freier Krebs-Henseleit-Lösung. Anschließend wurden Hypoxie- und Reperfusions-Versuche unter Kühlung und Stickoxyd- bzw. Carbogenbegasung durchgeführt. Hierbei erfolgte eine Einteilung in verschiedene Gruppen (Kardioplegie/Hypoxie/Reperfusion, Hypoxie/Reperfusion). Dabei befanden sich in dem unteren Teil der Mikroperfusionskammer nicht mit Fluoreszenzfarbstoff beladene Zellverbände. Diese wurden anschließend zu Kryoschnitten verarbeitet, auf einen Objektträger aufgebracht und mit PARP-1 Antikörpern ((Anti-Poly-ADP-Ribose)-Polymerase-1) auf stattgehabte Apoptose untersucht. Verwendet wurde für die Untersuchung der Calciumregulation Fura-2 AM. Dies ist ein Fluoreszenzfarbstoff, der neben der calciumsensitiven Anregungswellenlänge auch eine calciuminsensitive Anregungswellenlänge von 380 nm hat. Emissonswellenlänge ist jeweils 510 nm. Aus dem Verhältnis der gemessenen Fluoreszenzintensitäten wurde das Ratui R = calciumsensitiv340 nm / calciuminsensitiv380 nm berechnet. So konnten Störfaktoren bei der Untersuchung der Calciumregulation der Kardiomyozytenzelllverbände minimiert werden.

Bei der Grundlagenversuchen (N = 10) bestand bei den Kardiomyozyten eine intakte Calciumhomöostase. Nach Calcium-Entzug wurde ein Fallen der Ratiokurve um 0,15 ± 0,04 Ratioeinheiten beobachtet, sie stieg nach Calciumgabe wieder an und erreichte dann ihren Ausgangswert mit 1,60 ± 0,05 wieder (p < 0,05), hier Delta Ratio = RatiowertVersuchsende – RatiowertVersuchsanfang kleiner gleich 0,01.

Die Ergebnisse der fluorenzenzmikrosopischen Calcium-Messung (N = 60) zeigen, dass mit der Dauer der Hypoxie- und Reperfusionsphase ohne vorherige Perfusion mit Kardioplegielösung Delta Ratio = RatiowertVersuchsende – RatiowertVersuchsanfang signifikant anstieg: 20/7 min Hypoxie/Reperfusion Delta Ratio = 0,06, 40/13 min Hypoxie/Reperfusion Delta-Ratio = 0,15 und 60/20 min Hypoxie/Reperfusion Delta Ratio = 0,25 (hierfür p < 0,05). Im Gegensatz hierzu ergab sich bei gleichen Hypoxie- und Reperfusionszeiten jedoch mit Kardioplegiegabe jeweils ein Delta Ratio kleiner gleich 0,02 ohne signifikanten Calcium-Anstieg am Ende der Untersuchungen (p < 0,05). Dies spricht dafür, dass in den Gruppen ohne Kardioplegie die Calciumrückregulation nicht mehr intakt ist und dies als Ausdruck der Zellschädigung angesehen werden kann. Die Anzahl apoptotischer Zellen in der PARP-1 Färbung nahm gleichermaßen zu: In den Versuchen ohne vorherige Kardioplegie-Perfusion waren insgesamt bei 20/7 min Hypoxie/Reperfusion 21,9%, nach 40/13 min Hypoxie/Reperfusion 40,3% und nach 60/20 min Hypoxie/Reperfusion 57,9% der Zellen apoptotisch, während es in der Gruppen mit Kardioplegie kleiner gleich 15,6 % (bei 60/20 min Hypoxie/Reperfusion) zu einem signifikant geringeren Anteil apoptotischer Zelen kam (p < 0,05). Dies lässt auf eine Korrelation zwischen Delta Ratio und Anzahl apoptotischer Zellen pro Gesichtsfeld schließen. Es ergab sich somit eine zeitabhängige Zunahme der Apoptose-Rate bei Hypoxie/Reperfusion in den PARP Untersuchungen, die mit einem Calcium-Overload in der Perfusionsuntersuchungen korrelierte. Dies konnte durch vorherige Kardioplegiegaben vermindert werden.

Zusammenfassend lässt sich aus dieser Pilotuntersuchung schließen, dass das in dieser Arbeit entwickelte Versuchmodell mit einer Mikroperfusionskammer und einem angepassten Perfusionsystem zur Untersuchung von Physiologie und Pathophysiologie sowei Apoptose nach Hypoxie und Reperfusion bei Kardiomyozyten im Zellverband geeignet ist und weitere Erkenntnisse darüber liefern könnte.

The aim of this analysis was to develope adequate human cardiomyocyte models to investigate calcium homeostatsis and apotosis after simulation of hypoxia and reperfusion in a microperfusion chamber. A tissue model of human cardiomyocytes preserving the complex tissue environment was established. Cardiac biopsies were retrieved from the right auricle of patients undergoing elective coronary artery bypass grafting before cardiopulmonary bypass. The biopsies were submitted to varied conditions simulating hypoxia (hyp) and reperfusion (rep) in a microperfusion chamber. hyp/rep time sets were 20/7, 40/13 and 60/20 min. For analyses of the calcium homoeostasis the fluorescent calcium ion indicator FURA-2 and for apoptosis detection PARP-1 cleavage immunostaining were employed. Fluorescence images of FURA-2 loaded cardiac specimens were obtained at excitation wavelengths of 340 nm and 380 nm, with an emission wavelength of 510 nm. Via FURA-2 the intracellular calcium concentration can be displayed by using ratio values 340/380 to minimize negative effects. For evaluation of the impact on the calcium homoeostasis in the cardiomyocytes the initial and final calcium ratio values had to be analyzed. This was defined as Delta-ratio; Delta-ratio = ratiofinal-ratioinitial. Significant (p < 0.05) differences between both values were interpreted as calcium overload as a sign of disarranged calcium homoeostasis. Viable cardiomyocytes presented an intact calcium homoeostasis under physiologic conditions; Delta-ratio < 0,01.

Following cardioplegia and reperfusion a time-dependent elevation of cytosolic calcium as a sign of disarrangement of the calcium homoeostasis occurred. In the cardiac specimens treated with cardioplegia and reperfusion no significant (p < 0.05) cytosolic calcium increase and homoeostasis disarrangement could be detected, Delta ratio less than or equal 0,02. In the control groups with non-cardioplegia and reperfusion ratiofinal was significantly (p < 0.05) higher than the ratioinitial values, resulting in elevated Delta-ratio values correlating positively with the duration of hypoxia and reperfusion times: hyp/rep 20/7 min Delta Ratio = 0,06, hyp/rep 40/13 min Delta-Ratio = 0,15 and hyp/rep 60/20 min Delta Ratio = 0,25 (p < 0,05).

PARP-1 cleavage also showed a time-dependence whereas reperfusion had the highest impact on apoptosis. The longer the hypoxia and reperfusion periods lasted the higher was the number of PARP-1 positive or apoptotic cardiomyocytes hyp/rep 20/7 21,9%, hyp/rep 40/13 40,3% and hyp/rep 60/20 57,9%. Cardioplegia could significantly (p < 0.05) reduce apoptosis compared to cardiomyocytes not subjected to cardioplegia (hyp/rep 60/20 min less than or equal 15,6 % apoptotic cardiomyocytes).

In conclusion this human cardiac preparation served as a reliable cellular model tool to study calcium homeostasis and apoptosis in vitro. The apoptotic damage induced by the ischemia/reperfusion stimulus could be significantly reduced by the cold crystalloid cardioplegia.