Mutationsanalyse im ITCH-Gen bei Parkinson-Patienten

Abstract

Morbus Parkinson (Parkinson´s Disease, PD) ist eine progressive neurodegenerative Erkrankung, die durch die Degeneration dopaminerger Neurone der Substantia nigra und die Bildung von Lewy-Körperchen charakterisiert ist. Die genauen Ursachen der Neurodegeneration sind noch immer unbekannt; es wird ein multifaktorielles Geschehen angenommen, wobei neben Alter und Geschlecht vor allem genetische und umweltbedingte Faktoren eine Rolle spielen. Aufgrund der Entdeckung von Mutationen in Genen wie Parkin und UCH-L1 ist außerdem anzunehmen, dass Dysfunktionen im Ubiquitin-Proteasomen-System von zentraler pathogenetischer Bedeutung sind.

Itch ist – ebenso wie Parkin – eine E3-Ubiquitin-Protein-Ligase mit vielfältigen Aufgaben und nachgewiesener Aktivität im ZNS. Daher wurde ITCH im Rahmen dieser Arbeit einem Mutationsscreening unterzogen.

Für die molekulargenetischen Analysen stand ein Kollektiv von 286 Parkinson-Patienten und 260 Kontrollen zur Verfügung, für das alle kodierenden Exone des ITCH-Gens mittels PCR vervielfältigt und durch Heteroduplexanalysen mittels denaturierender Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (dHPLC) auf Sequenzauffälligkeiten hin untersucht wurden. Auffällige Proben wurden sequenziert, mit der Referenzsequenz von ITCH verglichen und in der Kontrollgruppe überprüft.

Dabei wurden neben einigen intronischen vier bislang unbekannte exonische Sequenzvarianten detektiert, die in der Kontrollgruppe nicht vorkamen und von denen zwei einen Aminosäurenaustausch zur Folge haben (c.83A>G, p.K28R ; c.246T>C, p.R82R ; c.1269A>G, p.Q423Q ; c.2119G>A, p.V707I). Die durch die Variante an Position 2119 ausgetauschte Aminosäure liegt dabei innerhalb der HECT-Domäne, die für die Ligase-Funktion von Itch essentiell ist.

Möglicherweise bewirken die beiden Aminosäuresubstitutionen eine Konformations-änderung des Proteins, was zu reduzierter oder fehlender Aktivität der E3-Ligase Itch führen und somit von pathogenetischer Bedeutung für den Morbus Parkinson sein könnte.

Es bleibt abzuwarten, was zukünftige funktionelle Analysen von Itch ergeben, dennoch haben die hier durchgeführten Analysen zunächst eine Assoziation zwischen seltenen Sequenzvarianten und dem Morbus Parkinson ergeben. Sollten sich diese Ansatzpunkte funktionell bestätigen, so wäre die Bedeutung des Ubiquitin-Proteasomen-Systems für den Morbus Parkinson erneut bekräftigt und die Suche nach therapeutischen Ansatzpunkten in diesem funktionellen System erweitert.

Parkinson´s Disease (PD) is a progressive neurodegenerative illness characterized by the degeneration of dopaminergic neurons in the Substantia Nigra and the accumulation of Lewy bodies. The detailed causes of this degeneration of neurons are still unknown; the proceeding is assumed to be dependent on a number of causes like age, sex and genetic or environmental factors. Since the detection of mutations in genes like Parkin and UCH-L1, it seems that dysfunction within the ubiquitin proteasome system has a central pathogenetic impact.

Itch is – like Parkin – an e3-ubiquitin protein ligase with various functions and proven activity within the central nervous system. Therefore, an analysis of mutations in Itch was implemented in the context of this dissertation.

A collective of 286 Parkinson´s Disease patients and 260 healthy controls was available for the moleculargenetic analyses. After the amplification of all coding exons of Itch by polymerase chain reaction (pcr), the fragments were searched for mutations using denaturing high-performance liquid chromatography (DHPLC). Conspicuous samples were sequenced in forward and reverse direction, compared to the reference sequence of Itch and reviewed within the control group.

We detected adjacent to some intronic four exonic variants which were unknown so far. All exonic variants were not found within the control group and two of them induce a substitution of the associated amino acid (c.83A>G, p.K28R ; c.246T>C, p.R82R ; c.1269A>G, p.Q423Q ; c.2119G>A, p.V707I). The exchanged amino acid on position 2119 is positioned within the HECT domain which is essential for the functioning of the ligase of Itch.

Possibly, the two substitutions of amino acids effectuate a change of conformation in the protein. This might reduce the activity of the e3-ligase Itch which could be significant for Parkinson´s disease.

Finally, our analyses show an association between some rare variants and Parkinson´s disease, nevertheless we should await further functional analyses of Itch. A functional affirmation of our results would again reinforce the meaning of the ubiquitin proteasome system for parkinson´s disease and broaden the research for therapeutic starting points in this functional system.