Spezifizierung der Methode der genspezifischen reversen Transkription am Beispiel des natürlichen Antisense Transkripts zu HIF-1alpha, aHIF und die Beschreibung von aHIF

Abstract

Als Standardmethode zur Festlegung der Orientierung einer Sequenz gilt bislang die genspezifische reverse Transkription. Es stellte sich in der vorliegenden Arbeit zunächst die Frage, wie spezifisch diese Methode tatsächlich ist. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass diese Methode nicht ausreichend spezifisch ist, um für die Orientierung eines Transkripts beweisend zu sein. Die Etablierung einer Methode mit der die Orientierung eines Transkripts eindeutig bestimmt werden kann ist jedoch für die weiterführende Beschreibung von natürlichen Antisense Transkripten, NATs, unabdingbar. In der vorliegenden Arbeit wurde eine Methode beschrieben, mit der die Orientierung einer Nukleotidsequenz, auch bei Vorliegen von fehlerhaftem Priming und einer komplizierten Sekundärstruktur, definiert werden kann. Dazu gehörte die Etablierung einer Realtime RT-PCR Methode zur Quantifizierung der Fehlerrate genspezifischer Umschriebe. Die Orientierung der Sequenz aHIF (antisense Hypoxia Inducible Factor) in Antisense Richtung konnte in dieser Arbeit bestätigt werden. Die weitere Charakterisierung ergab ein Poly(A)-Signal mit zugehörigem Poly(A)-Schwanz an ihrem 3’-Ende, dieser ist im Bereich der 3’-UTR (3’ untranslated Region) von HIF-1 alpha (Hypoxia Inducible Factor 1 alpha) lokalisiert und phylogenetisch stark konserviert. Das 3’-Ende von aHIF liegt an der Position chr14:61283835, das 5’-Ende konnte bis zur Position chr14:61287475 experimentell nachgewiesen werden. Das 5’-Ende von aHIF ist charakterisiert durch eine CpG-Insel, die vermutlich die Promotor Region für aHIF darstellt. Die Regulation von aHIF könnte über nachgewiesene HREs (Hypoxia Response Elements) vermittelt werden, dies ist ein Hinweis auf eine Regulation von aHIF durch HIF. Außerdem konnte das Vorliegen einer komplexen Sekundärstruktur, eines Stemloops, für aHIF gezeigt werden. Doppelsträngig vorliegende Abschnitte der Nukleinsäuresequenz von aHIF werden A-to-I editiert. Das Vorliegen des A-to-I Editings ist darüber hinaus, ebenso wie das Auffinden eines Poly(A)-Schwanzes, ein weiterer Hinweis auf die Antisense Orientierung der zugrunde liegenden RNA-Sequenz. Die in der vorliegenden Arbeit beschriebene Methode der Realtime RT-PCR zeigte, dass die Ermittlung der Orientierung eines Transkripts mittels genspezifischer reverser Transkription durch quantitative PCR-Analytik gegen Kontrollumschriebe der RNA erfolgen sollte.

Up to now the gene-specific Reverse Transcription has been regarded as the standard method of determination for the direction of a sequence. At first, this study concentrated on the question how specific this method is overall. The existing results showed a lacking specificity of this method to be evidentiary for the direction of a transcript. The establishment of a method, to determine the orientation of a transcript is indispensable for the continuing description of Natural Antisense Transcripts, NATs. This study describes a method, which can define the direction of a nucleotide sequence even with incorrect priming and a complicated secondary structure. Part of this was the establishment of a Realtime RT-PCR method to quantify the error rate of genespecific Reverse Transcription. The direction of the aHIF (antisense Hypoxia Inducible Factor) sequence in antisense direction could be confirmed in this study. Further characterization resulted in a Poly(A)-signal with associated Poly(A)-tail at the 3´-end. This is located in the region of the 3´-UTR (3’ untranslated Region) of HIF-1 alpha (Hypoxia Inducible Factor 1 alpha) and is phylogenetic strongly preserved. The 3´-end of aHIF is located at the position chr14:61283835, the 5´-end could be demonstrated experimentally up to the position chr14:61287475. The 5´-end of aHIF is characterized by a CpG-Island, which is supposedly the promotor region of aHIF. The regulation of aHIF could probably be mediated by verified HREs (Hypoxia Response Elements). This is a hint for the regulation of aHIF by HIF. Furthermore, the existence of a complex secondary structur, a stemloop, for aHIF was shown. Double-stranded segments of the nucleic acid sequence of aHIF are edited A-to-I. Moreover the existence of the A-to-I editing is, as well as the locating of a Poly(A)-tail, another indication for the antisence orientation of the underlying RNA-sequence. The method of Realtime RT-PCR, described in this study, showed the need to identify the direction of a transcript, using genespecific Reverse Transcription by quantitative PCR-analysis against control Reverse Transcriptions.