Elektroretinographische Untersuchung zur Erholung der a- und b-Welle nach Photopigmentbleichung bei der Ratte

Abstract

Ziel: Ziel dieser Arbeit war es, ein auf klinischen Standardgeräten verwendbares ERG- Protokoll zu erstellen, um an einer Kohorte gesunder Ratten Normwerte der Erholung des visuellen Zyklus nach Photopigmentbleichung zu erheben. Dazu war es nötig optimale Reizparameter wie Stimulusintensität und -dauer, Interstimulusintervall (ISI), Dauer und Intensität der Photopigmentbleichung zu definieren. Da die Rhodopsinregeneration von der Integrität der Photorezeptoren, des retinalen Pigmentepithels und deren Interaktion abhängig ist, kann der Vergleich mit diesen Normwerten in zukünftigen Studien bei denen die Funktion des visuellen Zyklus untersucht wird, dazu dienen beispielsweise die Toxizität neuer Substanzen zu testen. Methode: Zuerst wurden an 38 Brown-Norway Ratten die dunkeladaptierten Sensitivitätsparameter (VMax, k, und n) der b-Welle (Naka-Rushton) mittels ansteigender Lichtstimulusintensitäten (Umfang von 6 log cd.s/m²) und die dunkeladaptierte Maximalantwort (a-, b- Welle, oszillatorische Potentiale (OP)) bestimmt. Danach erfolgte ein paired-flash Protokoll (Testblitz 3 cd.s/m² gefolgt von einem Untersuchungsblitz 30 cd.s/m²) mit einem jeweiligen ISI zwischen 200 und 4000 ms, um die Erholungszeit der Stäbchen a-Welle im dunkeladaptierten Zustand nach kurzer Desensibilisierung zu ermitteln. Anschließend wurde die Erholung der a- und b-Welle nach Photopigmentbleichung über eine Dauer von 70 Minuten beobachtet. Alle 2,5 Minuten erfolgte eine Messung mittels eines Doppelblitz-Protokolls, welches eine semi-saturierte Stäbchen b-Welle (Blitz beta: 0,003 cd.s/m²) und eine gemischte Photorezeptorantwort (Blitz alpha: 10 cd.s/m²) hervorrief (ISI = 1 sec). Die Ratten wurden in 6 Gruppen entsprechend der Photopigmentbleichungsintensität eingeteilt: (A) 2,5 cd/m² für 25 sec, (B) 10 cd/m² für 25 sec, (C) 100 cd/m² für 25 sec, (D) 250 cd/m² für 25 sec, (E) 400 cd/m² für 30 sec und (F) 500 cd/m² für 60 sec. Die Anzahl der Tiere in den Gruppen A, B, C und D betrug 8, in E 38 (13 Ratten wurden zweimal gemessen zur Erfassung der Reproduzierbarkeit), und in F 5. Zuletzt wurden die Tiere helladaptiert mit einem Hintergrund von 25 cd/m² (blau) für 10 Minuten und die Antworten auf Einzelblitz Zapfen und Flicker ERG wurde anschließend aufgezeichnet. Für alle hier erhobenen Parameter wurden die Gesamtverteilung, der intraokulare und intraindividuelle Unterschied ausgewertet. Ergebnisse: Die Parameter der Naka-Rushton Funktion ergaben in der Gesamtverteilung (n=38) VMax: 858,53 ± 223,49 µV, für das rechte Auge wurden durchschnittlich Werte ± SD von 800,25 ± 267,97 µV, und für das linke Auge Werte ± SD von 916,82 ± 236,57 µV erreicht. Der absolute intraindividuelle Unterschied ± SD betrug 150,47 ± 142,61 µV. Gesamtverteilung k: -3,18 ± 0,26 log cd.s/m², intraokularer absoluter Unterschied im Durchschnitt ± SD: 0,13 ± 0,13 log cd.s/m2. Intraindividueller Unterschied ± SD für k betrug 0,13 ± 0,11 log cd.s/m2. Die dunkeladaptierte Maximalantwort ergibt eine a-Wellenamplitude (Mittelwert ± SD) von 243,09 ± 87,54 µV und eineGipfelzeit von 23,16 ± 1,44 ms. Bei der b- Welle betrug die Amplitude im Durchschnitt ± SD 977,64 ± 261,36 µV mit einer Gipfelzeit von 76,33 ± 7,24 ms. Die OPs (area under the curve) ergaben Werte von 2403,86 ± 955,64 µV*ms. Nach der Photopigmentbleichung kam es im Dunkeln zu einer halbmaximalen Amplitude der b-Welle, hervorgerufen durch Blitz alpha, in der Gruppe A nach 2,4 ± 0,09 sec, in B nach 1,16 ± 0,41 min, in C nach 3,52 ± 0,37 min, in D nach 17,54 ± 0,36 min, E nach 24,74 ± 0,67 min, und in F nach 70,37 ± 2,25 min. Die gemischte Photorezeptorantwort, hervorgerufen durch Blitz beta, zeigte eine schnellere Erholungszeit und eine halbmaximale Amplitude wurde in Gruppe D nach 5,83 ± 0,29 min, in Gruppe E nach 10,73 ± 0,14 min, und in Gruppe F nach 33,19 ± 0,92 min erreicht. Die Amplitude des Einzelblitz Zapfen ERGs betrug 100,79 ± 26,91 und die Flickeramplitude betrug 17,81 ± 5,8 µV. Schlussfolgerung: Durch Anwendung eines ERG- Protokolls, welches die vom ISCEV Standard geforderten Schritte (die dunkeladaptierte Stäbchen- und Maximalantwort, die OPs, die helladaptierte Zapfenantwort auf Einzelblitze und auf 30-Hz-Flicker) enthält und um zwei weitere Schritte, der Ermittlung der Erholungszeit nach kurzer Stäbchendesensibilisierung mittels paired-flash Technik und der Doppelblitzanwendung zur Erfassung der Regeneration der a- und b-Welle nach Photopigmentbleichung, ergänzt wurde, ist dieses in der Lage gezielt die Funktion des visuellen Zyklus zu beurteilen.

Purpose: To develop an electroretinographic (ERG) protocol to assess the recovery of the dark-adapted ERG response after photo pigment bleaching in rats. Methods: First, in n=39 wild-type brown-Norway rats, the scotopic parameters (Vmax, k, and n) of the b-wave intensity-response function (Naka-Rushton) were derived using increasing luminance stimulus, covering 6 log cd.s/m². Furthermore, a single flash was used (10 cd.s/m²) to derive the mixed (rod and cone) dark-adapted response. Oscillatory Potentials were obtained by filtering the responses elicited by the last flash with a frequency band-pass filter (75 – 100 Hz). Second, a paired flash protocol (test flash of 3cd.s/m² followed by a probe flash of 30 cd.s/m²) with inter stimulus interval varying from 200 to 4000 ms was applied to evaluate the a-wave recovery after short rod desensitization. Finally, response recovery after photopigment bleaching was evaluated every 2.5 minutes for up to 70 minutes after exposure to a white light using a double flash protocol that elicited both, a semi-saturated b-wave (flash beta: 0.003 cd.s/m²) and, after 1 sec, a saturated a-wave (flash alpha: 10 cd.s/m²). Rats were assigned into 6 groups according to the bleaching light used: (A) 2.5 cd/m² for 25 sec (n=8), (B) 10 cd/m² for 25 sec (n=8), (C) 100 cd/m² for 25 sec (n=8), (D) 250 cd/m² for 25 sec (n=8), (E) 400 cd/m² for 30 sec (n=38; 13 rats were measured twice for repeatability) and (F) 500 cd/m² for 60 sec (n=5). At last, all animals were light adapted with 25 cd/m² (blue) for 10 minutes to record cone single flash and flicker responses. Total distribution, intraindividual and intraocular differences were determined for all mentioned parameters. Results: Total distribution of parameter Vmax were: 858.53 ± 223.49 µV, (n=38; mean ± SD). In the right eye the mean values for Vmax were: 800,25 ± 267,97 µV, and for the left eye: 916,82 ± 236,57 µV with an absolute intraindiviual difference of: 150,47 ± 142,61 µV. Total distribution of parameter k: -3,18 ± 0,26 log cd.s/m², intraocular absolute difference ± SD: 0,13 ± 0,13 log cd.s/m2, intraindividual difference ± SD: 0,13 ± 0,11 log cd.s/m2. The combined maximum response (10 cd.s/m2) for the a-wave: 243.09 ± 87.54 µV, implicit time: 23.16 ± 1.44 ms, for the b-wave: 977.64 ± 261.36 µV, implicit time: 76.33 ± 7.24 ms. OP (area under the curve): 2403.86 ± 955.64 µV*ms. The test flash abolished the a-wave completely at 200 ms; recovery to half of maximum was found at 1267.78 ± 17.09 ms. After bleaching, in group A the b-wave elicited by flash beta had estimated half maximum amplitude after 2.4 ± 0.09 sec in the dark, in B: 1.16 ± 0.41 min, in C: 3.52 ± 0.37 min, in D: 17.54 ± 0.36 min, E: 24.74 ± 0.67 min, and in F: 70.37 ± 2.25 min. The a-wave elicited from flash alpha showed faster recovery dynamics and was evaluated in bleaching D: half maximum achieved at 5.83 ± 0.29 min, E: 10.73 ± 0.14 min, and F: 33.19 ± 0.92 min after bleaching. Cone single flash b-wave amplitude was 100.79 ± 26.91 µV and flicker amplitude was 17.81 ± 5.8 µV. Conclusions: A strict time and dark adaptation protocol allows assessment of response recovery after well defined bleaching levels of b-wave and a-wave amplitudes. Recommendable, seems an intermediate bleaching intensity as used in group E. The procedure can be used for evaluation of the influence of toxins and medicaments on the visual cycle or dark adaptation.