Immuntherapie der kindlichen ALL: Einfluss eines bispezifischen CD19*NKp46-Antikörpers auf die zytotoxische Aktivität von NK-Zellen gegenüber CD19 ALL-Blasten pädiatrischer Patienten

Abstract

Obwohl die kindliche ALL mittlerweile in über 80% der Fälle geheilt werden kann, gibt es nach wie vor keine entscheidenden Fortschritte bezüglich des Langzeitüberlebens von kindlichen Patienten mit einer high-risk ALL. Aktuelle Studien konnten bislang nicht zeigen, dass sich durch eine hämatopoetische Stammzelltransplantation die Prognose dieser Patienten wesentlich verbessern lässt. Neuere Therapieansätze, wie etwa der einer zellulären Immuntherapie nach SZT, stellen viel versprechende Versuche dar, die hohe Rezidivrate nach Transplantationen zu senken. Gerade nach nicht HLA-identischen Transplantationen kommt dabei den NK-Zellen eine wichtige Bedeutung zu, da in diesen Fällen eine T-Zell Gabe mit hoher Wahrscheinlichkeit eine GvH-Reaktion auslösen würde. Bedauerlicherweise zeigen gerade akute lymphatische Leukämien oft ein hohes Maß an Resistenz gegenüber alloreaktiven NK-Zellen. Eine zusätzliche humorale Immuntherapie mit entsprechenden monoklonalen Antikörpern könnte dort zu einer Verstärkung des GvL-Effekts nach Transplantation und NK-Zell Gabe führen, und damit das Therapieansprechen dieser Leukämien möglicherweise entscheidend verbessern.

Im ersten Teil dieser Arbeit wurden dazu verschiedene monoklonale Antikörper hinsichtlich ihres Einflusses auf die Zytotoxizität von NK-Zellen untersucht. Besonderes Interesse galt dabei den gegen die aktivierenden NCR’s NKp30, NKp44 und NKp46 gerichteten Antikörpern. Es zeigte sich, dass von diesen drei Antikörpern NKp46 den stärksten Effekt bezüglich einer Steigerung der zytotoxischen Aktivität der NK-Zelle besitzt. Dagegen zeigten der NKp30- sowie der NKp44-Antikörper wesentlich geringere Auswirkungen auf die NK-Zytotoxizität. Die effektivsten Lyseraten ließen sich allerdings mittels des Einsatzes von CD16-Antikörpern erzielen. Dabei lagen die dadurch erreichten spezifischen Lysewerte der P815-Zellen noch jeweils deutlich über den durch NKp46 erreichten Werten. Diese Ergebnisse belegen, dass über FcgRIII eine deutlich stärkere Aktivierung der NK-Zellen als über die verschiedenen NCRs vermittelt werden kann. Es konnte weiter gezeigt werden, dass sich die einzelnen NCRs in ihrer Wirkung vermutlich gegenseitig verstärken, während sich die FcgRIII-vermittelte ADCC und die NCR-vermittelte natürliche Zytotoxizität der NK-Zellen nicht gegenseitig weiters gegenseitig verstärken.

Im zweiten Teil der Arbeit wurde ein neu entwickelter, bispezifischer CD19*NKp46-Antikörper auf seine Effektivität hinsichtlich der Lysesteigerung von CD19 ALL-Blasten durch NK-Zellen getestet und untersucht. Neben diesem neuen Antikörper wurden zusätzlich ein chimärer CD19- sowie ein bispezifischer CD19*CD16-Antikörper eingesetzt, die beide bereits in anderen Studien untersucht und dort zu sehr effektiven Lyseraten geführt hatten. Bei Verwendung von isolierten NK-Zellen gesunder Spender als Effektorzellen ergab sich durch den Einsatz des bispezifischen CD19*NKp46-Antikörpers eine deutlich gesteigerte Empfindlichkeit der Blasten, einhergehend mit signifikant erhöhten Lyseraten. Allerdings führten sowohl der chimäre CD19-Antikörper als auch der bispezifische CD19*CD16-Antikörper zu einer im Vergleich dazu noch deutlich effektiveren Lyse der leukämischen Blasten. Bei Verwendung isolierter pMNCs frisch transplantierter Patienten als Effektorzellen zeigten sich die Effekte des CD19*NKp46-, bzw. des chimären CD19-Antikörpers jedoch wesentlich schwächer ausgeprägt. Dies lag vermutlich in einer noch vorhandenen, Transplantations-bedingten Funktionsbeeinträchtigung der regenerierten Spender NK-Zellen begründet.

Außerdem konnten wir in unserer Arbeit zeigen, dass eine Zugabe von humanem Serum zu den NK-Zellen vor der Inkubation zu einer starken Wirkungsabschwächung des effektiven chimären CD19-Antikörpers führte. Dieser Effekt wird vermutlich durch im Serum enthaltene Immunglobuline verursacht. Zwar lagen die dadurch erreichten, reduzierten Lyseraten noch immer über denen des NKp46-Antikörpers, jedoch könnte dieses Ergebnis auf eine schwächere Wirkung des CD19-Antikörpers in vivo, im Vergleich zu seiner sehr guten Wirkung in vitro, hindeuten. Da auch der bispezifische CD19*CD16-Antikörper zu sehr guten Lyseergebnissen führte und eine solche Wirkungsabschwächung im Vergleich zum chimären CD19-Antikörper eher unwahrscheinlich ist, stellt sein Einsatz eine interessante Option für die weitere Behandlung einer MRD in vivo dar und sollte in entsprechenden klinischen Studien weiter untersucht werden.

Although the overall prognosis of children with childhood ALL has become quite favorable – 80 % of the affected patients can be cured with current modalities – there is still no satisfying improvement regarding the long term prognosis of children suffering from high-risk all. Recent studies failed to show that hematopoietic stem cell transplantation can significantly improve this prognosis so far. New therapeutic approaches like a cellular immunotherapy following HSCT are promising to reduce the high rate of relapse after transplantation. Especially after HLA mismatched transplantation nk cells are of especial importance, since a donation of t-lymphocytes would most likely result in a graft versus host reaction. Unfortunately acute lymphatic leukemias in particular show a high degree of resistance against allo-reactive nk cells. An additional humoral Immunotherapy with the right monoclonal antibody could intensify the GvL-effect of nk cell infusions after transplantation and therefore improve the response to therapy of these leucemias essentially.

In the first part of our study we investigated various monoclonal antibodies regarding their influence on nk cell cytotoxity. The antibodies against the activating NCR's Nkp30, Nkp44 & Nkp46 were of especial interest. We could show that Nkp46 provides the strongest effect in enhancing the cytotoxic nk cell activitiy. In comparison, Nkp30 and Nkp44 showed much less influence on nk cytotoxity. However, the most effective lytic activity could be achieved when using antibodies directed against CD16. The achieved amounts of cell lysis with CD16 were considerably higher than the lytic results when using Nkp46 antibodies. This shows that a much stronger nk cell activation can be induced through FcgRIII than through the three NCR's. We could further show, that the single NCR's seem to enhance their action when acting concomitantly, while FcgRIII mediated ADCC and NCR mediated natural cytotoxity do not seem to potentiate each others action. In the second part we investigated and tested a newly developed bispecific CD19*NKp46 antibody regarding his efficiency in improving the lytic activity of nk cells against CD19 positive ALL blasts. We further compared the new antibody with two other antibodies, a chimeric CD16 and a bispecific CD19*CD16 antibody, ab's which showed very good lytic activity in other studies. When using isolated nk cells from healthy donors as effector cells the use of the CD19*NKp46 antibody led to a marked increase of the blasts susceptibility with significantly elevated blast lysis. However the chimeric CD16 as well as the bispecific CD19*CD16 antibody both led to even more effective blast lysis. Although, when using isolated PMNC's from freshly transplanted Patients as effector cells, the effects of the CD19*NKp46 antibody as well as the chimeric antibody were markedly reduced. The reason is presumably an existing transplantation-related impairment of the freshly regenerated nk cells.

We further showed that when the addition of human serum to the incubating nk cells led to a strong reduction of the action of the chimeric CD19 antibody. This effect is propably caused by the immunoglobulines contained in the added serum. Although these reduced lysis rates were still stronger than these with the Nkp46 antibody, this might indicate a weaker action of the CD19 antibody in vivo when compared to its very good action in vitro. In comparison, such a reduction is less likely when using the bispecific CD19*CD16 ab, an antibody which also led to very good lytic results. That's why CD19*CD16 might be an interesting option for the further treatment of minimal residual disease after transplantation, and should be further evaluated in clinical studies.