Charakterisierung der Photosensibilisatoren Hypericin und 5-Aminolävulinsäure für die Visualisierung von Medulloblastomen

Abstract

Medulloblastome sind die häufigsten malignen Tumoren im Kindes- und Jugendalter. Die Therapie besteht aus Resektion, Radiatio und Chemotherapie. Um das Verbleiben eines Resttumors bei Resektion zu verhindern, ist eine genaue intraoperative Tumoridentifizierung und -lokalisation erforderlich, um so die notwendige Radikalität des operativen Eingriffes zu verbessern. Die fluoreszenzbasierte Visualisierung von Tumorgewebe ermöglicht unter Verwendung eines geeigneten Fluoreszenzmarkers Tumorgewebe von normalem Gewebe zu differenzieren. Dadurch wird eine vollständige Tumorresektion ermöglicht. Diese Methode stellt somit eine vielversprechende Ergänzung der operativen Therapie dar. Hypericin ist ein natürlich vorkommender Fluoreszenzmarker und Photosensibilisator aus dem Johanniskraut, der in den vergangenen Jahren in der onkologischen Forschung, Diagnostik und Therapie zunehmend an Relevanz gewonnen hat. In vitro konnten ausgezeichnete photosensibilisierende Eigenschaften von Hypericin bei Glioblastomzelllinien nachgewiesen werden. Die antineoplastischen Eigenschaften durch Inhibition der Proteinkinase C, Inhibition der Tyrosinkinase und Induktion von Apoptose und Nekrose sind ebenso erwähnenswert und machen Hypericin auch für neuroonkologische Therapieansätze interessant. Der Fluoreszenzmarker 5-Aminolävulinsäure (5-ALA) wird heutzutage ebenfalls in mehreren klinischen Fachbereichen zur Forschung, Diagnostik und Therapie eingesetzt. Erste Erfolge wurden auch bereits in der Neurochirurgie erzielt. Die 5-ALA fluoreszenzbasierte Resektion von Glioblastomen hat die Prognose dieser Patientengruppe signifikant verbessert. Die Anwendbarkeit von Hypericin und 5-ALA zur Visualisierung von Medulloblastomen in vitro wurde in dieser Arbeit unter Anwendung qualitativer (Fluoreszenzmikroskopie) und quantitativer Messverfahren (Durchflusszytometrie/FACS-Analyse) an drei Medulloblastomzelllinien untersucht. Die beiden Messverfahren Fluoreszenzmikroskopie und FACS-Analyse wurden anhand von mathematischen Modellen verglichen. Des Weiteren wurde der Aufnahmemechanismus von Hypericin in die Medulloblastomzelle untersucht. Durch die in vitro Versuche konnte gezeigt werden, dass 5-ALA kein geeigneter Marker für die intraoperative Visualisierung von Medulloblastomzellen ist, da nur ein geringer Anstieg der Fluoreszenzintensität mittels Fluoreszenzmikroskopie und FACS-Analyse detektiert werden konnte. Bei Hypericin zeigte sich bei jeder der drei untersuchten Medulloblastomzelllinien eine konzentrations- und zeitabhängige intrazelluläre Hypericinaufnahme durch einen aktiven Transportmechanismus. Es konnte bewiesen werden, dass bereits mittels sehr geringer Hypericindosen (im Mikromolarbereich) und kurzen Inkubationszeiten eine starke Zunahme der Fluoreszenzintensität bei Medulloblastomzellen erreicht wird. Des Weiteren konnte mit Hilfe von mathematischen Modelle gezeigt werden, dass sich sowohl die Fluoreszenzmikroskopie als auch die FACS-Analyse zur Fluoreszenzintensitätsbestimmung eignen. Letztlich konnte über einen „warm-kalt“ Versuch nachgewiesen werden, dass es sich bei der Hypericinaufnahme bei Medulloblastomzellen um einen energieabhängigen und somit aktiven Aufnahmetransport handelt. Am ehesten ist von einer Endo- oder Pinozytose auszugehen. Diese überzeugenden in vitro Resultate lassen ein hohes Potential für die intraoperative Visualisierung und die Photodynamische Therapie von Medulloblastomzellen mit Hypericin annehmen. Hypericin könnte die first-line Therapie von Medulloblastomen erweitern und erbringt neue therapeutische Möglichkeiten zur Behandlung von Rezidiven.

Medulloblastoma is the most frequent tumor in infancy and adolescence. The therapy consists of resection, radiation and chemotherapy. To avoid any of the residual postoperative tumor remaining, it is necessary to have an exact intraoperative tumor identification and localisation, to improve the necessary radicality of the resection. Adequate photosensitisers in the fluorescence-based visualisation of tumor tissue allow the tumor tissue to be distinguished from healthy tissue. Thus a complete tumor resection is possible. Therefore this method is a promising addition to resection. Hypericin is a natural photosensitiser of St. John’s wort, which in the last few years has become more important in oncology research, diagnostics and therapy. Excellent photosensitising characteristics could be shown in in-vitro experiments. The antineoplastic characteristics by inhibition of protein kinase C, inhibition of tyrosin kinase and induction of apoptosis and necrosis are also worth mentioning and make hypericin also interesting for neurooncological therapeutic strategies. At the moment the photosensitiser 5-aminolevulinic acid (5-ALA) is also used in different clinic disciplines of research, diagnostics and therapy. In neurosurgery initial success has already been achieved. Fluorescence-based 5-ALA resection of glioblastoma significantly improved patients’ prognoses. The applicability of Hypericin and 5-ALA for visualisation of medulloblastoma in-vitro are investigated in three medulloblastoma cell lines by using qualitative (fluorescence microscopy) and quantitative (flow cytometry/FACS-analysis) measuring methods. Both methods, fluorescence microscopy and FACS-analysis, were compared using mathematical models. Furthermore, the uptake mechanism of hypericin in medulloblastoma cells was investigated. With the in vitro experiments it has been shown that 5-ALA is not suitable for the intraoperative visualisation of medulloblastoma due to a minimal increase of fluorescence intensity detected by fluorescence microscopy. With hypericin we have shown a concentration- and time-dependent intracellular uptake of hypericin in all three investigated medulloblastoma cell lines by an active transport mechanism. We proved that an intense increase in fluorescence intensity was achieved by minimal doses of hypericin and short incubation times. Furthermore with mathematical models we demonstrated that both fluorescence microscopy and FACS-analysis are suitable for measuring the fluorescence intensity. With a “warm-cold“ experiment we showed that the hypericin uptake in medulloblastoma cells is an energy dependent process and therefore it is an active uptake transport. It can be assumed that it is an endo- or pinocytosis. These convincing in vitro results can be expected to provide a high potential for intraoperative visualisation and photodynamic therapy of medulloblastoma with hypericin. Hypericin could extend the first line therapy of medulloblastoma and bring new therapeutic possibilities for the treatment of recurrences.